茶叶黄酮提取条件的优化.docx
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茶叶黄酮提取条件的优化
茶叶黄酮提取条件的优化
[摘要]本论文主要是对茶叶黄酮提取条件进行优化。
在单因素试验基础上，采用析因试验设计对影响茶叶黄酮提取量的因素进行筛选，得到具有显著效应的四个因素：
乙醇浓度、提取时间、提取温度和固液比；根据Box-Behnken试验设计原理进行响应面分析，以黄酮提取量为响应值，确定较优工艺条件为：
乙醇浓度80%、提取时间81min、提取温度70℃和固液比1:
33（g/ml），验证实验茶叶黄酮提取量为50.08（mg/g）,与预测值50.0995（mg/g）基本相符。
结果表明，析因试验设计结合响应面分析法可以很好的对茶叶黄酮提取条件进行优化。
[关键词]茶叶黄酮；析因试验；响应面法
OptimizationOnTheFlavonoidsExtraction
ConditionsOfTea
BiologicalEngineeringWEIXiao-cui
Abstract:
Thispaperismainlytooptimizetheextractionconditionsofteaflavonoids.Basedonthesinglefactortrial,thefactorialexperimentaldesignwasusedtoselectfactorswhichaffecttheextractionconditionsofteaflavonoids,thenthefourfactorswhichhavesignificanteffectofethanolconcentration,extractiontime,extractiontemperatureandsolid-liquidratiowereobtained.Usingflavonoidsextractionyieldasresponsevalue,theresponsesurfacemethodologyaccordingtotheexperimentaldesignofBox-Behnkenwasusedtooptimizetheextractionconditions.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsofflavonoidsextractionwereasfollows:
ethanolconcentration80%,extractiontime81min,extractiontemperature70℃andsolid-liquidratio1:
33（g/ml）.Theextractionyieldofteaflavonoidcouldreach50.08（mg/g）intheverificationexperiment,theresultwasconsistentwiththepredictivevalue50.0995（mg/g）.Theresultsshowedthatthefactorialexperimentaldesigncombinedwithresponsesurfacemethodologycouldbeusedtooptimizetheextractionconditionsoftheteaflavonoids.
keywords:
teaflavonoids;factorialexperiment;responsesurfacemethodology
目录
1绪论………………………………………………………………………………1
1.1茶叶概况………………………………………………………………………1
1.1.1茶叶简介…………………………………………………………………1
1.1.2茶叶中所含主要化学成分及药用价值………………………………1
1.2黄酮类化合物概述…………………………………………………………1
1.2.1黄酮类化合物的药理作用………………………………………………2
1.2.2黄酮类化合物的提取方法………………………………………………3
1.3响应面法简介………………………………………………………………4
1.4本论文研究的目的、意义及主要内容………………………………………5
1.4.1研究目的、意义…………………………………………………………5
1.4.2主要研究内容……………………………………………………………5
2茶叶黄酮提取条件的优化…………………………………………………………6
2.1材料…………………………………………………………………………6
2.1.1试验材料…………………………………………………………………6
2.1.2试剂……………………………………………………………………6
2.1.3主要仪器设备……………………………………………………………6
2.2方法…………………………………………………………………………6
2.2.1茶叶黄酮提取工艺流程…………………………………………………6
2.2.2黄酮类化合物测定原理…………………………………………………6
2.2.3芦丁标准曲线的绘制……………………………………………………6
2.2.4单因素试验……………………………………………………………7
2.2.5析因试验设计………………………………………………………………7
2.2.6响应面试验设计…………………………………………………………8
2.2.7验证试验…………………………………………………………………8
2.2.8茶叶黄酮提取量计算公式………………………………………………8
2.3结果及分析…………………………………………………………………9
2.3.1芦丁标准曲线的绘制及结果…………………………………………9
2.3.2单因素试验结果………………………………………………………10
2.3.3析因试验结果…………………………………………………………14
2.3.4响应面试验结果………………………………………………………15
2.3.5响应面分析立体图和对应等值线图…………………………………17
3结论及展望………………………………………………………………………21
3.1结论…………………………………………………………………………21
3.2展望…………………………………………………………………………21
参考文献……………………………………………………………………………22
致谢…………………………………………………………………………………24
1绪论
1.1茶叶概况
1.1.1茶叶简介
茶属于山茶科山茶属茶组植物。
茶叶是茶的嫩叶、嫩芽；其性凉、味苦、甘。
茶属双子叶植物，约30属，500种，分布于热带和亚热带地区。
我国有14属，397种，主产长江以南各地，其中茶属Camellia和何树属Schima等均极富经济价值。
茶树为乔木或灌木，叶互生，单叶，无托叶；花常两性，单生或数朵聚生，腋生或顶生；萼片5-7，覆瓦状排列；花瓣通常5片，覆瓦状排列；果为蒴果，或不开裂的核果状[1]。
1.1.2茶叶中所含主要化学成分及药用价值
茶叶中含有多种有机化学成分和无机矿物元素。
有机化学成分主要有：
茶多酚类、黄酮类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、色素等。
无机矿物元素主要有：
钾、钙、镁、钴、铁、锰、锌、铜、碘、硒等。
茶叶中的水溶性和脂溶性维生素有十多种，其中维生素B和维生素C族尤其丰富。
茶有多种功效，如：
安神、明目、止渴生津、清热、消暑、解毒、祛风解表、益气力、延年益寿等。
近年来的研究发现，长期喝茶对辐射病、心血管疾病、癌症等具有一定的预防和治疗作用[2]。
1.2黄酮类化合物概述
黄酮类化合物是在植物中分布十分广泛的一类天然化合物。
其在植物体中大部分与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。
绝大多数的植物都含有黄酮类化合物，黄酮类化合物在植物的生长、发育、开花、结果以及防菌抗病等方面都有着十分重要的作用。
黄酮类化合物是茶叶的重要成分，同样具有许多重要的药理作用。
黄酮类化合物（flavonoids）是指以2-苯基色原酮为母核而衍生的一类黄色色素。
其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物[3]。
天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。
由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。
又由于分子中γ-吡酮环上的氧原子能与强酸生成盐而表现为弱碱性，因此曾称为黄碱素类化合物。
根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：
黄酮和黄酮醇；黄烷酮和黄烷酮醇；异黄酮；异黄烷酮；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮；黄烷和黄烷醇等。
图1-1C6-C3-C6的基本骨架
Fig.1-1C6-C3-C6basicframe
1.2.1黄酮类化合物的药理作用
（1）对心血管系统的作用
研究表明,多数黄酮能降低动物的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平。
佟继铭等[4]研究黄芩茎叶黄酮调血脂作用,表明总黄酮对大鼠实验性高脂血症有一定的调脂作用。
韩淑英等[5]用SD大鼠制作高血脂模型,研究荞麦叶总黄酮调血脂及抗脂质氧化的作用。
结果表明:
总黄酮能明显抑制高脂血症大鼠血清脂蛋白的失调,增加血清SOD（超氧化物歧化酶）活力,降低血清和肝组MDA（丙二醛）含量。
孙经武等[6]给予44例冠心病患者口服醋柳黄酮20mg/d,2个月后观察血浆oxLDL及MDA的变化,结果发现oxLDL、MDA显著下降,作者认为口服醋柳黄酮对治疗冠心病有益。
大规模临床试验亦证实了黄酮类化合物能显著降低冠心病的发病率及死亡率。
（2）抗菌及抗病毒作用
黄酮类化合物具有一定的抗菌及抗病毒作用。
Dastidar等人[7]究表明，腹腔注射苦参异黄酮A或6，8-二异戊烯基染料木黄酮对伤寒沙门氏菌处理的小鼠具有显著的保护功效。
沙棘总黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有较好的抑菌作用，冯煦等[8]人实验证实，北柴胡茎叶总黄酮具有较强的抗乙型流感病毒作用，其中TFB0.09g/kg剂量组能明显降低乙型流感病毒感染小鼠肺指数，且作用优于已知的抗病毒西药。
（3）抗肿瘤作用
研究表明,黄酮类化合物具有抗肿瘤作用。
胡福良等[9]从蜂胶液中提取出的黄酮类化合物对S180肿瘤生长有良好抑制作用，其抑瘤率达到55.8%-80.8%。
韩国的Young-KyoonKim等[10]从北桑寄生中分离提取黄酮类化合物，在对非小细胞肺癌细胞株A549,卵巢癌细胞株SKOV-3,皮肤黑色素瘤细胞株SKMEL-2,中枢神经细胞肿瘤XF498等实验后，发现对肿瘤细胞有抑制作用。
（4）抗氧化、清除自由基作用
大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化性和清除自由基作用，而黄酮类化合物的一些药理活性也往往与这一作用相关。
吴英[11]等研究表明沙棘黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤时能明显减轻缺血再灌注损伤区超微结构的病理改变，显著提高大鼠心肌组织SOD活性并减少MDA的生成。
TFH对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能与提高自由基清除酶活性及抑制脂质过氧化反应有关。
（5）消炎、镇痛作用
黄酮化合物具有消炎、镇痛作用。
宋必卫等[12]对芦丁的镇痛作用研究结果表明芦丁（6.25-100mg/kg,ip）呈剂量依赖性的抑制小鼠扭体反应；芦丁（50-100mg/kg,ip）明显提高小鼠嘶叫棘激阀值，显著延长小鼠热板舔足反应潜伏期，表明芦丁有镇痛作用，其镇痛作用比阿司匹林强，但比吗啡弱。
（6）保肝作用
肝脏疾病严重危害人类的健康,由肝毒性物质引发的氧化应激反应是导致肝损伤的重要原因。
多种肝脏疾病,如肝癌、酒精性脂肪肝、肝纤维化等都与此相关，而黄酮类化合物可以通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤。
王超云等[13]研究发现黄芩苷能显著增加肝组织、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性及谷胱甘肽（GSH）水平,提高组织的抗氧化能力,通过抑制自由基的产生,降低了生物膜脂质过氧化的发生,增强生物膜的稳定性,从而对化学性肝损伤起到保护作用。
（7）其他
此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性。
1.2.2黄酮类化合物的提取方法
（1）有机溶剂提取
甲醇和乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇（90%左右）适宜于提取苷元，60%左右的乙醇或甲醇溶液适宜于提取苷类。
由于甲醇有一定毒性，在工业提取中应选用无毒的乙醇作为提取溶剂。
另外，乙醇作提取溶剂也方便回收再利用，以降低企业的生产成本。
（2）微波提取
微波加热时透入内部的能量被物料吸收置换成热能对物料的加热，形成独特的物料受热方式，具有均匀性的特点，同时具有反应高效性和强选择性等特点，而且操作简便，副产物少，提取量高及产物纯度高等优点。
陈业高[14]等人用微波法对甘草进行黄酮提取，表明了微波法不仅能提高黄酮的提取量，更大大缩短了提取时间，使单位时间内的黄酮产出量进一步提高。
在黄酮类化合物的提取上取得了良好的效果。
（3）超临界萃取
超临界流体萃取是利用超临界流体在临界压力和临界温度附近具有的特殊性能作为溶剂进行萃取的一门科学，最常用的超临界流体为CO2。
超临界流体萃取法具有提取条件温和、活性成分不易被破坏、消耗少、传质速率快、溶剂残留少等优点，且最终的提取效率和经济性同其他方法相比也有很大的提高，已有多种中药材中的黄酮类物质采用超临界CO2萃取[15-18]。
（4）酶浸渍提取
最近几年，随着酶技术的快速发展，科学工作者充分利用了酶的特性发展了新的提取方法。
酶浸渍法是指在黄酮提取过程中，通过加入恰当的酶发生转糖反应和酶解反应而使产品黄酮得率和含量大大提高的新兴技术，并且其提取条件温和，有利于黄酮类化合物活性保护，且成本低、安全。
刘志伟[19]等用酶法提取仙人草中的黄酮化合物，平均得率为1.301%，比传统提取方法提高了9.79%。
结论纤维素酶辅助有利于提高仙人草黄酮提取得率。
（5）超声波辅助提取
超声波提取黄酮类化合物，是目前比较新的方法，其原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速原料有效成分的浸出提取。
另外，还利用其次效应，如机械震动、扩散、击碎等，使其加速被提取成分的扩散、释放。
超声波提取法大大缩短了提取时间，提高了原料有效成分的提取量及原料的利用量。
王延峰[20]等人研究了银杏叶黄酮的超声提取法，并与连续热回流中的索氏提取进行了比较。
最佳操作条件为：
超声波频率40kHz,处理时间10min,结果表明超声波法优于索氏提取法。
1.3响应面法简介
响应面法（responsesurfacemethodology，简称RSM）最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的，就是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面，其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数。
本质上来说，响应面分析法是一套统计方法，用这种方法来寻找输入变量值的变异或不确定性之后的最佳响应值。
响应面法最常用的是CentralCompositeDesign响应面分析法和Box-BehnkenDesign响应面分析法。
CentralCompositeDesign，简称CCD，即中心组合设计，有时也称为星点设计。
其设计表是在两水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，通常实验表是以代码的形式编排的,实验时再转化为实际操作值,（一般水平取值为0,±1,±n,其中0为中心值,n为极值）。
Box-BehnkenDesign，简称BBD，也是响应面优化法常用的实验设计方法，不包含嵌入因子或部分因子设计，其设计具有位于试验空间边缘中点处的处理组合，并要求至少有三个因子。
以三因子为例，其中0是中心点，+1,-1分别是相应的高值和低值。
在相同数量因子条件下，与CCD设计相比,BBD设计的设计点通常较少，所以运行成本较低。
但是，因为没有嵌入因子设计，所以不适用于顺序试验。
另外，BBD设计没有将所有试验因素同时安排为高水平的试验组合，对某些有安全要求或特别需求的试验尤为适用[21-22]。
1.4本论文研究的目的、意义及主要内容
1.4.1研究目的、意义
本论文利用响应面法对茶叶黄酮提取条件进行优化，以期提高茶叶的药用价值，扩大茶叶资源的利用率，从而提高茶叶的经济价值。
随着社会的进步、人类物质文化水平的不断提高，工作和生活压力也不断增大，导致人们的健康状况明显降低，高血压、高血脂等疾病层出不穷；心绞痛、冠心病等更是成为了中老年人的杀手，因此开发治疗这些疾病的药物迫在眉睫。
而黄酮类化合物分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，有消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩大毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能，进而具有抗癌、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎镇痛、调节免疫、降血压等作用。
黄酮类化合物又广泛存在于天然植物中，在茶叶中的含量也普遍较高，因此开发茶叶黄酮意义重大。
1.4.2主要研究内容
为优化茶叶黄酮提取条件，首先采用单因素试验对影响茶叶黄酮提取的因素和水平进行筛选；其次采用析因试验得到显著影响因素；再次用响应面法分析出茶叶黄酮提取的较优工艺参数；最后对结果进行验证实验，得到较优工艺条件。
2茶叶黄酮提取条件的优化
2.1材料
2.1.1试验材料
茶叶：
散装竹叶青南阳理工对面万德隆超市
2.1.2试剂
亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇、正丁醇、乙酸丁酯等，以上试剂均为分析纯。
2.1.2主要仪器设备
721-GW可见光分光光度计恒温振荡器
低温台式大容量离心机
电子天平
上海精密科学仪器有限公司
郑州杜甫仪器厂
上海安亭科学仪器厂
北京赛多利斯仪器系统有限公司
2.2方法
2.2.1茶叶黄酮提取工艺流程
茶叶→烘干→粉碎→浸提→离心→上清液→冷却干燥→黄酮粗品
2.2.2黄酮类化合物测定原理
黄酮类化合物在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下，与硝酸铝生成黄色的黄酮络合物，在碱性环境下显红色。
采用NaNO2-Al（NO3）3显色法，利用分光光度计在较大稳定吸收波长507nm处测定吸光度值，对照芦丁标准曲线，测得黄酮的含量，计算出黄酮的提取量。
2.2.3芦丁标准曲线的绘制
精密称取烘干恒重的芦丁标准品15mg，用80%乙醇溶解，摇匀并定容至100ml的容量瓶中，制成浓度为0.15mg/ml的芦丁标准液。
分别取上述芦丁标准液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于25ml容量瓶中，分别向7个容量瓶中加入6.0，5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0.0的80%乙醇溶液，然后各加入5%亚硝酸钠溶液1.00ml,充分震荡后静置6min，再向每个容量瓶加入10%硝酸铝溶液1.00ml，充分震荡后静置6min，再向容量瓶中加入10%氢氧化钠溶液10.00ml用80%乙醇定容至刻度，摇匀，显色15min，以空白试剂为参比液，于波长507nm处测其吸光度。
以吸光度为纵坐标，芦丁标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.2.4单因素试验
（1）提取溶剂选择
分别准确称取1.0g茶叶粉，在固液比1:
25（g/ml）,提取温度70℃，振荡速度120r/min条件下提取60min，分别采用不同提取溶剂：
水、乙醇、正丁醇、乙酸丁酯，进行提取。
（2）温度对黄酮提取量的影响
分别准确称取1.0g茶叶粉，70%乙醇作为提取溶剂，在固液比1:
25（g/ml）,振荡速度120r/min，不同温度条件下提取60min，提取温度分别为30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃。
（3）固液比对黄酮提取量的影响
分别准确称取1.0g茶叶粉，70%乙醇作为提取溶剂，在提取温度为70℃,振荡速度120r/min的条件下提取60min，固液比分别为1:
10，1:
15，1:
20，1:
25，1:
30,1:
35。
（4）时间对黄酮提取量的影响
分别准确称取1.0g茶叶粉，70%乙醇作为提取溶剂，在固液比1:
25（g/ml）,提取温度为70℃，振荡速度120r/min，不同时间的条件下提取，提取时间分别为20min，40min，60min，80min，100min，120min，140min。
（5）提取剂浓度对黄酮提取量的影响
分别准确称取1.0g茶叶粉，乙醇作为提取溶剂，在固液比1:
25（g/ml）,提取温度为70℃，振荡速度120r/min的条件下提取60min，乙醇浓度分别为40%，50%，60%，70%，80%，90%。
（6）提取次数对黄酮提取量的影响
分别准确称取1.0g茶叶粉，70%乙醇作为提取溶剂，在固液比1:
25（g/ml）,提取温度为70℃，振荡速度120r/min的条件下提取60min，分别提取1、2、3、4次。
2.2.5析因试验设计
根据单因素试验，确定提取溶剂为乙醇，对乙醇浓度、提取时间、提取温度、固液比等因素进行析因试验分析。
因素水平如表2-1所示：
表2-1析因试验因素水平表
Table2-1Factorialexperimentfactorlevelslist
水平
乙醇浓度
X1（%）
提取时间
X2（min）
提取温度
X3（℃）
固液比
X4（g/mL）
-1
40
20
30
1:
15
+1
70
80
70
1:
30
2.2.6响应面试验设计
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合析因试验结果，进一步进行四因素三水平的响应面分析试验，27个试验点可以分为两类,其一是析因点，自变量取值在X1,X2,X3,X4所构成的三维顶点，共有24个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。
试验因素及水平见表2-2所示：
表2-2响应面分析试验因素水平表
Table2-2Theresponsesurfaceanalysisexperimentwatchfactorlevelslist
水平
乙醇浓度
X1（%）
提取时间
X2（min）
提取温度
X3（℃）
固液比
X4（g/mL）
-1
60
60
60
1:
25
0
70
80
70
1:
30
1
80
100
80
1:
35
2.2.7验证实验
根据单因素试验、析因试验分析和响应面分析结果，确定较优工艺条件。
在此条件下重复三次实验来验证试验结果是否符合响应面模型方程式预测的最佳响应值。
2.2.8茶叶黄酮提取量计算公式
黄酮提取量:
Y1（mg/g）=50x/0.6m
其中：
Y1－为茶叶黄酮提取量
x－为吸光度值A对应的黄酮浓度
m－为称取的茶叶粉质量
50－为定容后提取液的体积
0.6－为稀释时吸取的提取液体积
2.3结果及分析
2.3.1芦丁标准曲线的绘制及结果
将浓度为0.15mg/ml的芦丁标准液在507nm处测吸光度值，如表2-3所示：
表2-3芦丁标准液在50
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