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生物分离技术实训指导书

二００五年三月

1、综合实训一：

L-胱氨基酸的制备………………………………………1

2、综合实训二：

树脂柱纯化法制备谷光甘肽…………………………3

3、综合实训三：

锌盐沉析法提取胰岛素…………………………………6

4、综合实训四：

DNA制备……………………………………………………9

5、综合实训五：

菠萝蛋白酶的制备………………………………………12

6、综合实训六：

卵磷脂的制备及鉴定…………………………………15

7、综合实训七：

银耳多糖制备及鉴定和含量测定……………………17

综合实训一L-胱氨基酸的制备（4学时）

一、目的要求

1.学习胱氨酸的提取分离原理和方法。

2.学会吸附分离技术的原理。

二、实验原理

胱氨酸是由两个β-巯基-α-氨基丙氨酸组成的含硫氨基酸。

胱氨酸呈六角形片状白色洁净或洁净粉末，无味，微溶于水，不溶于乙醇及其他有机溶剂，易溶于稀酸和碱液中。

在热碱液中易分解。

胱氨酸的等电点（pI）为4.6，熔点为260～261℃。

胱氨酸比半胱氨酸稳定，在体内转变成半胱氨酸后参与蛋白质合成和各种代谢过程，又促进毛发生长和防止皮肤老化等作用。

胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马茂、羽毛及动物角等的蛋白质中，其中人发含量最高，达17.6%。

胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种，因此可利用这种特性，通过酸水解，从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中，分离提取胱氨酸。

三、材料用具

（一）材料

废杂毛。

（人发或猪毛）

（二）试剂

盐酸、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、氨水、硫酸铜、硝酸、硝酸银、硫化氢、硫氰酸铵、亚硫酸钠、碘化钾、活性炭、骨炭粉、硫酸甲醛溶液、溴液。

（三）器具

玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、不锈钢桶、搪瓷桶、离心机、玻璃布、白纱布、温度计、酸度剂、布氏漏斗、3号垂熔漏斗、2号砂心漏斗、恒温水浴、碘量瓶、滴管、试管、移液管、量筒、烧杯、pH试纸、酸度剂。

四、实验方法

（一）流程见图1

（二）操作

1.清洗用60℃左右的热水，加少量洗涤剂，搅拌洗涤4～6min，洗去吸附在毛发上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗干净，滤干，放在通风处晒干或烘干备用。

2.水解按毛发的量，量取2倍30%工业盐酸，加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸汽加热到70～80℃，立即投入清洗晒干的毛发，继续加热，间歇搅拌，使温度均匀，升温到100℃开始记温，每隔0.5h记温一次，在1～1.5h内升温至110℃左右（即罐温），以后继续维持罐压14.6kPa，水解13h左右，水解期间要有回流装置，保证水解酸度，使水解完全，水解时间可从水解罐内溶液温度达100℃时计算。

水解完全后，停止回流，立即趁热过滤，先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱布抽滤，将滤液移到中和锅内，滤液用1：

10盐酸冲洗2～3次，准备中和。

3.中和将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度为30%～40%的氢氧化钠溶液，当中和到pH达4.0时，停止加碱液，然后改用乙酸钠饱和溶液中和到pH为4.8左右，停止搅拌，静止10～12h。

用涤纶布过滤沉淀物，甩干或吊干，即得粗品。

中和时温度应保持在50℃左右，而且要在0.5h内完成。

4.提纯称取适量的胱氨酸粗品，加入粗品量13%～14%的工业盐酸，搅拌30min左右，等粗品全部溶解后，在加入糖用活性炭，加热到90～98℃，在此温度下恒温搅拌2～3h，然后过滤脱色液，滤液加热到80～85℃，在搅拌下加入30%氢氧化钠溶液，调节pH至4.8时，静置。

使结晶沉淀完全。

5.精致、干燥称取适量胱氨酸提纯后的粗品，加入5倍量的1：

12的盐酸，加热到40℃时，加入5%骨炭粉，升温到60℃，保温搅拌1h。

然后用布氏漏斗过滤，滤液在经过3号垂熔漏斗过滤，滤液应无色透明。

将溶液移入搪瓷缸中，搅拌下加入10%氨水调节溶液pH至4.8，静置5～6d，即有胱氨酸精品析出，过滤出结晶，用无离子水洗至无氯离子，干燥即得成品。

五、注意事项

1.用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。

保证其准确性。

2.水解终点的判定，加入10%氢氧化钠溶液2mL，在滴加硫酸铜溶液几滴，摇匀后，如仍有明显的天蓝色表明水解完全。

六、思考题

1.胱氨酸的物化性质是什么，通常提取胱氨酸选用什么原料?

2.提取胱氨酸时应注意什么条件变化？

综合实训二：

树脂柱纯化法制备谷光甘肽（6学时）

一、目的要求

1.了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理；

2.熟悉树脂柱具体应用技术；

3．掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。

二、实验原理

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。

自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液的红细胞和眼球中。

动物组织中含量较高，而植物组织中的含量较低。

正常人体内还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSHG）的比例为100：

1，还原性谷胱甘肽（GSH），分子小，是机体内重要的活性物质，它具有清除自由基、减毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。

在医学上、食品行业及运动保健上具有广泛的应用。

制备谷胱甘肽（GSH）的方法，国内主要为酵母菌生物合成，每克酵母菌干细胞含GSH18mg。

所采用的分离提纯GSH的方法主要有两种，铜盐法和离子交换树脂法。

本次实训采用市售或经发酵法制得的干酵母为原料，经加热提取，离心除杂质，阳离子树脂交换、有机溶剂沉析等分离纯化得GSH湿品，经真空干燥后即得GSH成品。

三、材料用具

（一）材料

干酵母100g市售732阳离子交换树脂（60～80目）

（二）试剂

5mol／L30mL、1mol／L3000mL的硫酸溶液，2mol／L、1mol／L盐酸溶液丙酮、硅藻土、2mol／L氢氧化钠、2％偏磷酸溶液、5％碘化钾溶液、淀粉指示剂、0.001mol／L的碘酸钾溶液。

（三）器具

低温冰柜、冷冻离心机、不锈钢锅、搪瓷桶、冷冻干燥机、温度计、酸度计、层析柱、布氏漏斗、电瓷炉。

四、实验方法

（一）流程见图2

（二）操作

1.提取将干酵母置于不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入3倍体积的蒸馏水，再加入6倍体积沸腾的蒸馏水，升温至90～100℃，保持10min，然后速冷至2～10℃。

2.粗提液用5mol／L硫酸调节pH值至2.8～3.0，冷冻离心（3000r／min,5～10℃）15min，收集离心液。

在离心液中加0.5％硅藻土助滤，抽滤得到黄色抽提液待用。

3.粗提液层析抽提液上732阳离子交换树脂柱（装置如图-3），流速6mL／min，然后用1mol／L硫酸洗脱，洗脱流速2mL／min,25min左右开始收集5mL流出液,进行快速含量测定,当流出液滴定值超过0.2mL／mL时，开始收集，滴定值低于0.2mL／mL时停止洗脱。

（1）732阳离子交换树脂装柱将市售732阳离子交换树脂磨碎，筛选出60～80目。

物理方法处理后，先以4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍体积的2mol／L氢氧化钠溶液搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，最后水洗至中性。

按要求装柱后用1mol／L硫酸平衡备用。

（2）GSH含量快速测定（碘量法）

取5mL待测样品，置于250mL锥形瓶内，加入5mL2％偏磷酸溶液，1mL5％碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.001mol／L的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止。

计算滴定值（碘酸钾溶液／待测样品，mL／mL）

4.沉析将洗脱液倾入搪瓷桶中，在搅拌的条件下加入溶液体积10倍的冷丙酮（2～8℃），然后静置沉淀过夜，过滤收集沉淀。

5.干燥将沉淀置于真空干燥器中干燥，即得成品。

五、注意事项

1.用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。

保证其准确性。

2.离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定收集洗脱液的间隔时间，随着

洗脱时间的增加，收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。

六、思考题

1.绘制出GSH标准曲线能否快速确定滴定值的大小？

如何绘制出GSH标准曲线?

2.提取时为何加热后又要速冷

综合实训三：

锌盐沉析法提取胰岛素（8学时）

一、目的要求

1.了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理；

2.掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。

二、实验原理

胰岛素是迄今为止治疗胰岛素依赖性糖尿病的特效药物。

胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。

其等电点为5.30～5.35，在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80％以下乙醇或丙酮中溶解；在90％以上乙醇或80％以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。

胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。

以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。

为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。

三、材料用具

（一）材料

冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况下用液氮或干冰速冻）

（二）试剂

16％、27％氯化钠溶液，2％、10％柠檬酸溶液，12mol／L硫酸及浓硫酸，

6mol／L盐酸及浓盐酸，65％、82％乙醇（W/W），4mol／L氨水、浓氨水，

氯化锌，丙酮，硅藻土，五氧化二磷,20％醋酸锌，尼龙布（或纱布）

（三）器具

离心机、烧杯、布氏漏斗（8cm）、抽滤瓶（500mL）分液漏斗量筒、酸度计、水浴锅、滤纸、搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。

四、实验方法

（一）流程见图4

（二）操作

1．预处理将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。

2.提取将冻胰片100g置于不锈钢锅中，加入300mL82％乙醇（W/W），在10～13℃加入12mol／L硫酸，调节pH2.8～3.0，搅拌提取40min。

加入6mol／L盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5h，离心（3000r/min）15min，残渣加入65％乙醇150mL，用6mol／L盐酸调pH至2.0，10～13℃搅拌提取2h，离心（3000r/min）15min分离残渣。

合并两次提取液。

3.碱化将提取液置于搪瓷桶中，然后冷至0～5℃，用浓氨水调pH7.8～8.0，加入硅藻土（每100g胰脏加6g），抽滤，滤液随即用混合酸（盐酸4mL、硫酸1mL、水4mL）酸化至pH2.5，待沉淀完全后虹吸清液，用尼龙布（或纱布）过滤，弃去沉淀，温度控制在0～3℃。

4.锌沉析将碱化液置于不锈钢锅中，然后在搅拌的条件下加入氯化锌溶液（每100g胰脏加3g氯化锌，先配成30％～50％溶液，用6mol／L盐酸调至pH2.5后加入），温度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸上清液，用尼龙布（或纱布）过滤除去沉淀，清液用液氨水调pH至6.8～7.0，于5℃过夜。

5.脱脂虹吸除去清液，沉淀过滤收集，溶于5倍量蒸馏水，用6mol／L盐酸调pH2.7～2.8，12～15℃放置。

次日放出下层清液（上层脂肪再用5倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，作下批锌沉淀溶解用）。

6.盐析将清液置于搪瓷桶中，在搅拌的条件下用6mol／L盐酸调pH至2.5，在温度25℃加27％氯化钠盐析。

所得第一次盐析物溶于20倍量蒸馏水中，用6mol／L盐酸调pH至2.5，再加入16％氯化钠盐析，过滤，收集第二次盐析物。

7.丙酮、锌沉析将盐析物置于搪瓷桶中，然后在搅拌的条件下加入7倍量水、3倍量丙酮，用4mol／L氨水调pH至4.5，冷至0～5℃过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用4mol／L氨水调pH至6.0，加入20％醋酸锌（按每100g投料加入0.03mL），析出白色沉淀。

8.结晶干燥过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按每100g投料所得沉淀物计）：

2％柠檬酸0.5mL，20％醋酸锌0.0065mL，丙酮0.16mL，蒸馏水稀释至1mL。

结晶液冷却至0～5℃，用4mol／L氨水碱化至pH8.O，过滤除去沉淀。

用10％柠檬酸调至pH6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，以五氧化二磷真空干燥，得成品。

五、注意事项

1.采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。

要立即深冻，–15℃保存备用。

如用液氮或干冰速冻，效果更好。

在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。

2.胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。

光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。

超声波能引起其非专一性降解。

3.还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素c及多数重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。

六、思考题

1.为何在胰岛素的制备中溶液的pH值不能超过8.0

2.碱化过滤时为何加硅藻土？

综合实训四：

DNA制备（4学时）

一、目的要求

1、了解密度梯度离心分离原理，了解DNA粗提方法。

2、掌握密度梯度离心制作过程及方法。

二、实验原理

在较大的离心力作用下，不同的DNA由于其大小、形状和密度不同，而悬浮在不同密度的位置上，从而达到分离。

核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。

在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA为40μg/mL。

紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。

DNA浓度计算公式：

C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260×稀释倍数。

三、材料用具

（一）材料

新鲜的鸡肝

（二）试剂

生理盐水（冷）、5%十二烷基磺酸钠溶液、45%乙醇、95%乙醇（冷）、乙醇（冷）、

丙酮（冷）、氯化钠粉末、5%、10%、20%、30%蔗糖溶液（5%蔗糖溶液配制：

称取蔗糖5g溶于100mL蒸馏水液中，加5g活性炭，于沸水浴中加热25min，过滤取清液）

（三）器具

离心机、灭菌离心管（10mL）、烧杯（1L）、大三角瓶、天平、量筒、匀浆机、1.0mL注射器、超速离心机、No.22针头、紫外分光光度计等。

四、实验方法

流程见图5

（二）操作

1．蔗糖密度梯度溶液的制备将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。

此离心管于20～25℃静置2～3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。

若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5～1h。

温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。

为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。

2．DNA样品制备

（1）组织破碎：

取一定量的新鲜的鸡肝，加4倍量生理盐水，经组织捣碎机捣碎lmin，匀浆，2500r/min离心30min,沉淀用同样体积生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀物悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3min。

（2）除杂蛋白：

上述组织液中加入2倍量5％的十二烷基磺酸钠，用45％乙醇作溶剂，搅拌20～30min,在0℃，2500r/min离心，收集上清液并加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，

（3）精制：

将粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％的十二烷基磺酸钠，用1/10体积45％乙醇作溶剂，搅拌0.5h,经5000r/min离心15min，上清液中加入NaCl至终浓度1mol/L，再缓慢加入冷95％乙醇，DNA析出。

（4）样品制备：

取上述DNA溶于适量蒸馏水中，用紫外分光光度计测其含量。

备用。

3．梯度离心

（1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mLDNA样品溶液。

加样时，用注射器吸入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。

不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面。

（2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0℃以25000r/min离心分离1～3h。

4．梯度溶液的分部收集

离心后，取出离心管，置于冷室中。

用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。

用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。

5．DNA浓度测定

用适量双蒸水稀释收集的样品，用紫外分光光度计测定各管DNA样品的A260，根据公式计算DNA浓度。

C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260×稀释倍数。

五、注意事项

1、注意操作温度。

2、组织捣碎机捣碎的时间不可过长。

六、思考题

为什么所用离心管等器皿必须灭菌？

蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？

综合实训五：

菠萝蛋白酶的制备（4学时）

一、目的要求

1.了解单宁沉析法提取菠萝蛋白酶的原理；

2.掌握有机酸沉析的基本操作技术。

二、实验原理

菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺，其成品为浅黄色、无定形粉末，稍溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，最适pH值为7，微有异臭；其酶活力能被半胱氨酸激活，而受重金属抑制。

用途广泛，用于干酪、明胶、水解蛋白的生产；也可作为一种食品添加剂，可使肉质嫩化、啤酒澄清；还可以治疗生物体内水肿及多种炎症，能迅速溶痂，对正常组织无害，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

提取菠萝蛋白酶的主要生产方法有单宁沉析法、高岭土吸附法和超滤法。

本实验采用单宁沉析法，所用的乙二胺四乙酸根是一种螯合物，可有效地螯合原料中重金属离子，以避免其与酶结合而使酶失去活性；抗坏血酸则具有还原性质，分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态，从而有效地保护酶活性；锌离子、硫代酸钠、L一半胱氨酸对酶有激活作用。

酶湿品于-15℃以下冻结后，体积膨大，便于干燥，有利于保护其活性。

三、材料用具

（一）材料

鲜菠萝1500g

（二）试剂

0.5％、0.1％EDTA-Na（二乙胺四乙酸钠）、0.5％乙酸锌溶液、0.06％、0.1％抗坏血酸溶液、0.2％单宁（别名鞣酸）、1.5％氯化钠溶液、0.5％硫代硫酸钠溶液、1％L-半胱氨酸溶液（配制方法：

称取L-半胱氨酸0.1g，加水10mL，加lmol／L盐酸溶液6～8滴使之溶解，然后用6mol／L的NaOH溶液中和至pH3～4）。

（三）器具

大烧杯（≥500mL）、容量瓶、榨汁机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、离心机、水浴锅、布氏漏斗、不锈钢锅、冰箱、干燥器、板框压滤机。

四、实验方法

（一）流程见图6

（二）操作

1.压榨取鲜菠萝1500g，去刺、洗净，用压榨机压出汁液，取1000g鲜菠萝汁，加5％苯甲酸钠溶液10mL搅匀，用于防腐。

2．除杂鲜菠萝汁用离心（3000r/min）20min（或送入板框压滤机），除去杂质。

3.加稳定剂将澄清液移入搪瓷桶中，在搅拌条件下，加入0.5％EDTA-Na80mL、O.1％的抗坏血酸溶液60mL。

4.加单宁立刻加入O.2％的单宁85mL，在4℃下静置1h，离心（3000r/min）10min弃去上清液，收集沉析物（酶复合物）。

5.洗脱

（1）将沉析物倒入烧杯中，加0.5％乙酸锌溶液20mL，搅拌均匀，静止5min；加0.06％抗坏血酸溶液30mL，搅匀，静止10min；加1.5％氯化钠溶液20m1，搅匀，静止10min；最后再加0.5％EDTA溶液20mL，搅匀，静止5min；离心（3500r／min）10min，弃去上清液，得菠萝蛋白酶沉析物。

（2）把上述沉析物倒入烧杯中，加0.5％硫代硫酸钠溶液20m1，搅匀，静止5min；加1％L-半胱氨酸溶液10mL，搅匀，离心（3500r／min）10min，弃去上清液，得菠萝蛋白酶湿品。

6．冷冻干燥将菠萝蛋白酶湿品放入冰箱中，于-15℃冷冻10～15h，解冻后离心（3000r／min）10min，沉淀放入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥5～10h，取出后研磨成粉末，得菠萝蛋白酶纯品，低温（2～10℃）下保存。

五、注意事项

1.对原料的选取要选70％～80％成熟度的新鲜菠萝。

2.提取操作中避免热、酸、碱、重金属盐、紫外线对产物的影响，防止酶变性。

3.在整个操作中注意温度的变化以及体系的pH值的变化，要经常用试纸

检测溶液的pH值，要使之保持稳定。

六、思考题

1.如何测得实验所得物的酶活性？

2.如何提高菠萝蛋白酶收率和酶的活力？

综合实训六：

卵磷脂的制备及鉴定（4学时）

一、目的要求

1、熟悉从蛋黄中制备卵磷脂的原理；

2、掌握卵磷脂制备的基本操作及鉴定技术。

二、实验原理

利用卵磷脂可溶于乙醇的性质，将卵黄溶于乙醇，卵磷脂从卵黄中转移到乙醇溶液中，可分离提取出来，而蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。

但由于乙醇溶剂抽提时，其他脂质也一起被抽提，如甘油三酯、甾醇等。

利用卵磷脂不溶于丙酮的性质，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。

无机盐和卵磷脂可生成络合物沉淀，因此可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质，再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质，这样可大大提高卵磷脂纯度。

三、实验用品

1、材料

新鲜鸡蛋、卵磷脂对照品、GF254硅胶板。

2、试剂

（1）10%氯化锌溶液；

（2）2%氯仿溶液

（3）无水乙醇、95%乙醇、0.1%乙醇

（4）丙酮（冰）

（5）甲醇

（6）碘

3、器具

离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计、钳锅。

四、实验过程

1．粗提：

室温下，取适量的鸡蛋卵黄用2倍于卵黄体积的95％乙醇进行提取，混合搅拌，离心分离（3000r/min,5min），将沉淀物重复提取3次，回收上清液；然后、减压蒸馏（45℃）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物质；加入丙酮，抽滤，分离出沉淀物，真空干燥（40℃，30min），得到淡黄色的粗卵磷脂，称重。

2．精制：

取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10%乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10％的氯化锌水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h,再用丙酮复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精卵磷脂；干燥；称重。

3．鉴定：

（1）薄层色谱分析

将卵磷脂样品与对照品分别配成2％氯仿溶液，用GF254硅胶板进行层析，展开剂为氯仿：

甲醇：

水（65：

25：

4）,层析完毕后，取出薄板，干燥，碘蒸气显色。

（2）紫外吸收光谱测定

将一定量卵磷脂样品溶于无水乙醇，配成0.1％乙醇溶液，用紫外分光光度计扫描其在90-400nm的吸收光谱，可测得卵磷脂的紫外最大吸收峰。

卵磷脂紫外最大吸收峰在215nm波长。

五、注意事项

1、碘蒸气显色时，应保证层析干燥，碘蒸气量不可过浓。

2、紫外吸收光谱测定时样品与对照品溶液浓度应相同。

六、思考题

1、讨论影响卵磷脂得率的主要因素。

2、根据紫外吸收光谱分析所制备的卵磷脂的纯度。

综合实训七：

银耳多糖制备及鉴定和含量测定（4学时）

一、目的要求

1.了解银耳多糖制备的基本原理；

2.掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术。

二、实验原理

银耳是我国传统的一种珍贵药用真菌。

银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。

银耳多糖具有明显提高机体免疫功能、抑制肿瘤转移、抗炎症、抗放射、抗血栓、降血糖等作