细胞周期调控.docx

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细胞周期调控

细胞周期调控

细胞周期分为：

合成DNA的时期称为DNA合成期（S期），进行DNA拷贝分配和细胞分裂的时期称为有丝分裂期（M期），在M期结束后和S期开始前的一段间隙称为G1期，而在S期结束后和M期开始前的间隙则称为G2期。

真核细胞内有一个调控机构，使细胞周期能有条不紊地依次进行。

细胞周期的准确调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均是十分重要的，细胞周期各时相中有各自特异性的细胞周期蛋白控制细胞周期有序地进行。

概述

细胞是有机体的基本结构单位和功能单位，而细胞周期则是保证细胞进行生命活动的基本过程。

细胞周期分为：

合成DNA的时期称为DNA合成期（S期），进行DNA拷贝分配和细胞分裂的时期称为有丝分裂期（M期），在M期结束后和S期开始前的一段间隙称为G1期，而在S期结束后和M期开始前的间隙则称为G2期。

真核细胞内有一个调控机构，使细胞周期能有条不紊地依次进行。

细胞周期的准确调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均是十分重要的，细胞周期各时相中有各自特异性的细胞周期蛋白控制细胞周期有序地进行。

细胞周期

何为细胞周期？

细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂,结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。

通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。

在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

细胞周期（cellcycle）是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。

细胞周期运转总图

（一）间期

　　间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

　　1.G1期　此期长短因细胞而异。

体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。

在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等做准备。

　　2.S期　是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。

与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。

S期一般需几个小时。

　　3.G2期　为分裂期做最后准备。

中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。

G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

（二）分裂期

　　M期：

细胞分裂期。

　　细胞分裂期：

前期，中期，后期，末期。

　　细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。

一般需1～2小时。

　　1.前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。

染色体短而粗，强嗜碱性。

两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。

随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。

核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

　　2.中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。

染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。

从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体，2个为性染色体。

男性的染色体组型为44+XY，女性为44+XX。

分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

　　3．后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。

与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

　　4．末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

　　G0期：

暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。

　　在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：

①增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。

这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环；②不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（endcell）；③暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。

它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。

在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。

如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

有丝分裂

细胞周期调控的研究背景

Rao和Johnson（1970、1972、1974）将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体（prematurelycondensedchromosome，PCC），这种现象叫做早熟染色体凝集（prematurechromosomecondensation）。

G1期PCC为单线状，因DNA未复制。

S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。

G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。

不同形态的PCC

不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子（maturationpromotingfactor，MPF）。

早在1960s，YoshioMasui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂（GerminalVesicleBreakdown，GVBD），后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子（MF）。

后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。

这类物质被统称为MPF。

1960sLelandHartwell以芽殖酵母 

Cdc25表达不足，细胞长得过长而不分裂；Wee1表达不足，细胞很小就开始分裂了

为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因（celldivisioncyclegene，CDC）。

如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。

Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。

裂殖酵母细胞周期

1970sPaulNurse等人以裂殖酵母为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：

裂殖酵母cdc2、cdc25的突变型和在限制的温度下无法分裂；wee1突变型则提早分裂，而cdc25和wee1都发生突变的个体却会正常地分裂。

进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。

而weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。

这也解释了为何cdc25和wee1双重突变的个体可以恢复野生型的表型。

芽殖酵母细胞周期

Cdc25表达不足，细胞长得过长而不分裂；Wee1表达不足，细胞很小就开始分裂了

1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白（cyclin）。

后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。

用海洋无脊椎动物和两栖类的卵为实验材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细胞分裂是同步化的。

1988年M.J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化（图13-19）。

后来PaulNurse（1990）进一步的实验证明P32实际上是CDC2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。

MPF=CDC2+CyclinB

细胞周期的“分子引擎”

M期促进因子

MPF为M期促进因子（Mphrase-promotingfactor），是M期细胞中特有的物质，被称为是细胞周期调控的引擎分子。

在成熟的卵母细胞、分裂期粘菌、酵母等中可提取到这种促细胞分裂因子。

由两个亚基组成，一种是细胞周期蛋白，一个是依赖周期蛋白起作用的蛋白激酶，其中周期蛋白为调节亚基。

能够促使染色体凝集，使细胞由G2期进入M期的因子。

MPF为促有丝分裂因子，是M期细胞中特有的物质

在结构上，它是一种复合物，由周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cdk）和G2期周期蛋白组成，其中，周期蛋白对蛋白激酶起激活作用，周期蛋白依赖性蛋白激酶是催化亚基,它能够将磷酸基团从ATP转移到特定底物的丝氨酸和苏氨酸残基上。

酵母细胞周期中只有一种Cdk,而哺乳动物的细胞周期中有多种Cdk,所以哺乳动物的MPF是由Cdk1和周期蛋白B组成的复合物。

　　有丝分裂期细胞与间期细胞融合后，会使间期细胞产生形态各异的染色体凝集，称作早熟染色体凝集。

这一现象表明，分裂期细胞中可能存在某种诱导染色体发生凝集的因子。

在成熟卵母细胞分裂期黏菌酵母等中提取到了这种促细胞分裂因子，称为成熟促进因子（Maturation-promotingfactor）。

MPF是由催化亚单位和调节亚单位组成。

催化亚单位是由cdc2基因编码的一类蛋白质，只有与调节亚单位结合后，才具蛋白激酶活性，促使细胞进入分裂期。

调节亚单位是一类随细胞周期变化而周期性出现或消失的蛋白质，称为细胞周期蛋白，它具有细胞周期特异性及细胞类型特异性。

MPF的活化过程

关于MPF的研究

20世纪中叶，随着DNA双螺旋结构的发现和遗传信息中心法则的确立，产生了以核酸和蛋白质为主要研究对象的分子生物学。

1960年代晚期，在华盛顿大学工作的科学家哈特韦尔，利用酵母遗传学和分子生物学方法开始寻找控制细胞周期的基因。

他和他的同事把一种单细胞生物——芽殖酵母（S.cerevisiae）放在不同的温度下生长，得到了许多种类的温度敏感突变株，其中有一些突变株停止在细胞周期某些特定的阶段。

哈特韦尔回忆说，“我们立刻被它们（温度敏感突变株）所显示出来的关于细胞分裂的大量信息所震惊。

” 

最初分析这些突变株的目的，是希望提出一系列相互连接和交叉的代谢途径，以描述出一种细胞周期的代谢线路图。

这种想法的产生部分归结于细菌和噬菌体遗传学对噬菌体装配系统成功的描述，这种描述揭示了噬菌体的头部和尾部是如何进行装配的，以及一些关键的蛋白质如何被用作其他蛋白质装配的模板。

人们可以想象，类似的一个过程衔接着另一个过程的线路，也同样适用于细胞周期。

1970年代初期，哈特韦尔实验室从这些温度敏感突变株内鉴定出了大量的破坏细胞周期进程的突变基因。

这些温度敏感突变体中的一种——cdc28突变株，被证明是了解从S期向M期转换的关键。

进一步的分析显示，Cdc28基因的功能对细胞周期中的特定转换是必须的。

在哈特韦尔进行这一系列研究的时候，纳斯正在英国的一所大学读研究生，从事氨基酸代谢方面的研究。

当时的纳斯对哈特韦尔的工作有着很深的印象：

“我感到这种遗传学方法非常有效。

”得到博士学位后，纳斯在英国爱丁堡大学开始了自己的研究生涯。

他选择了另一种酵母——裂殖酵母（S.pombe），来寻找控制细胞周期的基因。

这种酵母形状像一个长的圆柱体，不断在其中部形成隔膜，然后分裂成两个细胞。

细胞分裂发生在隔膜形成以后。

通过采用与哈特韦尔相似的研究方法，纳斯很快就发现一种称为wee的细胞周期突变体，这种突变体细胞进入有丝分裂期后分裂成为比正常细胞小得多的子代细胞。

他克隆到了wee的等位基因Cdc2，这是一个细胞周期进程所必须的基因。

这类突变体的存在表明，Cdc2基因一定是非常重要的有丝分裂调控因子。

在有丝分裂过程中，Cdc2不仅是开始其过程所必须的，而且还决定着有丝分裂期的时间长短。

随后的工作表明，Cdc2基因编码一个分子量为34000的蛋白激酶。

现在人们已知道，由蛋白激酶调节的蛋白质磷酸化，是真核细胞内改变酶和其他蛋白质活性最常见的过程之一。

因此，蛋白激酶成为在细胞分裂过程中控制细胞结构和功能改变的重要手段。

后来的研究表明，Cdc2和Cdc28基因的序列相差无几；预测的蛋白质氨基酸序列表明Cdc2和Cdc28蛋白彼此有很高的同源性，都属于蛋白激酶家族的成员。

分子生物学的研究结果证实，这两个基因在这两种亲缘关系很远的酵母菌中可以相互替代。

1987年，纳斯在人细胞中找到了与它们同源的Cdk1基因，它与Cdc2和Cdc28基因几乎完全一样，并且可以用来挽救裂殖酵母的cdc2突变株。

这些研究表明，从低等生物到高等生物，细胞周期都是通过一个同样的机制进行调控。

一幅简化的控制图景可以描述为：

特定的蛋白激酶启动并磷酸化特定的蛋白质，这些蛋白质性质由此而来的改变，使得整个细胞从S期进入M期。

这种模型也可以用来解释细胞周期其他各个时相的转换。

当然，不同有机体的细胞周期具体的控制机理并非完全一样。

在单细胞真核生物里，负责细胞周期内蛋白质磷酸化的蛋白激酶通常只有一种，芽殖酵母中是Cdc28，裂殖酵母里是Cdc2。

而在多细胞真核生物中，参与细胞周期的蛋白激酶则有许多种。

例如在人体细胞内，控制G1期的主要是CDK2、CDK4和CDK6，S期和G2期依赖于CDK2，而M期则主要由CDK1负责。

一、细胞周期蛋白（cyclin）

1953年霍华德等人首先提出细胞分化是通过细胞周期完成的理论； 

1983年，Evans等首次在海洋无脊椎动物中发现一组蛋白质呈周期性出现，并调节细胞的生长，其被确定为细胞周期蛋白。

1988年科学家们发现细胞周期调节蛋白能与细胞分化周期编码蛋白结合并激活相应的蛋白激酶，从而促进细胞分裂。

至少发现有11种不同的cyclin，分别为A、B1、B2、C、D1、D2、D3、E、F、G和H。

其中8种主要的cyclin己被分离。

根据cyclin调控细胞周期时相的不同，可分为G1期和M期两大类。

各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。

（一）G1期胞周期蛋白（G1—cyclin）

 作用在G1期或G1/S交界期，启动细胞周期和促进DNA合成的cyclin，G1期是增殖细胞唯一能接受从外界传入的增殖或抑制增殖信号的时期。

1cyclinD：

cyclinD1，cyclinD2，cyclinD3 

2cyclinC 

3cyclinE：

cyclinE1，cyclinE2

1、cyclinD 

cyclinD首先在酵母菌中被发现，它能激活CDK6，驱动细胞通过START。

它有3个亚型，包括D1、D2、D3，具组织特异性。

cyclinD1与cyclinD2功能相似，都在酵母子细胞中起作用，cyclinD3在酵母母细胞中起作用。

在细胞周期的调节中cyclinDl是一个比其它cyclins更加敏感的指标。

cyclinD1的编码基因位于11q13上，全长约15kb，与其他周期素相比最小，主要是因为其N末端缺少一个“降解盒”片段,该蛋白半衰期很短，不足25min。

在有生长因子的情况下，cyclinD1在细胞周期中首先被合成，并于G1中期合成达到高峰，cycllnD1的功能主要是促进细胞增殖，是G1期细胞增殖信号的关键蛋白质，被视为癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。

cyclinD2的编码基因位于12p13，称为CCND2，在正常的二倍体细胞及Rb阳性肿瘤细胞中cyclinD2的表达呈波动状态，其峰值在G1晚期。

给G1期细胞微量注射cyclinD2抗体，可使表达cyclinD2的淋巴细胞停滞在G1期，说明cyclinD2是细胞从G1期向S期转移所必须的。

cyclinD3的编码基因位于染色体6p21，称为CCND3。

正常和恶性组织中未见cyclinD3基因异常及其蛋白的过度表达。

目前认为cyclinD3似乎不直接反映恶性度，而是肿瘤发展到晚期的结果。

2、cyclinC 

cyclinC与所有cyclin的同源性最低，主要在果蝇及人类细胞中发现，它与其他G1-cyclin不同的是其mRNA和蛋白质水平在G1早期达最高，可能在G1早期发挥作用。

3、cyclinE 

cyclinE在cyclinD之后出现，于G1／S转化过程中表达，人类cyclinE基因定位于染色体19q12-q13。

cyclinE中1／3段为高度保守区，称为周期蛋白盒，此为CDKs结合所必须。

在G1晚期发挥正调控细胞周期的作用。

cyclinE蛋白的C端存在PEST序列（一个富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（S）、丝氨酸和苏氨酸（T）残基的PEST序列，在蛋白质转化和降解中起作用）。

cyclinE基因及其产物的表达在细胞周期的G1中期上升，至G1晚期或S早期达高峰，然后经与“PEST”序列有关的蛋白水解或与S期激酶相关蛋白-2（S-phasekinase-associatedproteinSKP2）泛素路径降解而迅速下降。

缺乏SKP2的细胞表现cyclinE蛋白降解不足并不断积累。

（二）M期细胞周期蛋白（M-cyclin）

在G2／M交界期诱导细胞分裂的cyclin。

1、cyclinA 

cyclinA在cyclinE之后很快表达。

cyclinA是G1期向S期转移的限速因素，也可促进细胞从G2期向M期的转化。

它由CCNA基因编码。

2、cyclinB 

cyclinB是有丝分裂蛋白激酶的一个亚单位，能促进G2期向M期的过渡。

哺乳动物cyclinB在S晚期合成。

cyclinA、cyclinB在M期通过泛素途径降解，这是细胞脱离有丝分裂所必须。

cyclinA与cyclinB之间存在多种差异：

（1）周期积累方式不同，cyclinA含量在S期及G2期初最高，cyclinB在G2期末含量最高； 

（2）结合的催化亚基不同，cyclinA与p33cdc2结合，cyclinB与p34cdc2结合； 

（3）功能不同，cyclinA在S期发挥作用，与DNA的复制完成有关，cyclinB在G2／M交界期发挥作用，诱发细胞分裂； 

（4）对细胞分裂的影响不同，cyclinB持续升高可使细胞停滞于分裂期，而cyclinA的持续升高并不影响细胞分裂的完成。

细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。

CyclinD与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F

在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。

向细胞内注射CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。

同样将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的。

在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件。

Cyclin的周期性变化

在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC，将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。

分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒（destructionbox，图13-25）。

当MPF活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与cyclin结合，cyclin随之被26S蛋白酶体水解。

G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有降解盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。

泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。

共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。

26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。

CyclinB的降解途径

在蛋白质的泛素化过程中，E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后E1将泛素交给E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素结合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素连接酶）的作用下将泛素转移到靶蛋白上。

参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类，其中SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三个蛋白构成的复合体）负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上，APC（anaphasepromotingcomplex）负责将泛素连接到M期周期蛋白上。

二、细胞周期素依赖激酶（CDK）

CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase，CDK），因此CDC2又被称为CDK1，激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。

这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。

因此，CDK激酶和其调节因子又被称作细胞周期引擎。

Cdk的三种活性状态:

无活的催化亚基部分A;与周期蛋白结合引起T-loop变成部分有活性的状态B;在CAK作用下完全活化C。

目前发现的CDK在动物中有7种。

各种CDK分子均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。

CDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括CDK1—7种。

CDK的主要生物学作用是启动DNA的复制和诱发细胞的有丝分裂，以复合物形式出现。

三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKI）

细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CKI）对细胞周期起负调控作用，CKIS是CDK抑制蛋白，通过竞争性地抑制cyclin或cyclin—CDK复合物，导致cyclin生物学功能丧失；对细胞生长起负调控作用。

目前发现的CKI分为两大家族：

①Ink4（Inhibitorofcdk4），如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4·cyclinD1、cdk6·cyclinD1复合物。

②Kip（Kinaseinhibitionprotein）：

包括P21cip1（cyclininhibitionprotein1）、P27kip1（kinaseinhibitionprotein1）、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantige