小麦过氧化物酶活性的测定.docx
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小麦过氧化物酶活性的测定
毕业设计（论文）
干旱胁迫下小麦过氧化物酶
题目活性的变化
作者
学院生命科学学院
专业生物科学
学号
指导教师
二0—三年六月五日
干旱胁迫下小麦过氧化物酶活性的变化
摘要
以豫麦69种子为材料，利用沙基培养法培养小麦幼苗，用Hoagland培养液浇灌。
在小麦幼苗培养到第10天时，对其中一半的小麦幼苗进行干旱处理。
在干旱处理后的第3天、6天、9天进行过氧化物酶活性的测定，采用比色法，用分光光度计在470nm波长下测量其吸光值，以每分钟ODfi变化表示其酶活性大小。
实验结果表明：
在干旱胁迫下，小麦幼苗过氧化物酶活性提高，随干旱时间延长，过氧化物酶活性增长速率减慢。
关键词：
小麦；干旱；过氧化物酶
Abstract
WetakeYumai69asthematerial,culturethewheatseedlingswithChaki,andirrigatethemwithHoaglandculturemedium.Halfofzhewheatseedingsweredividedunderdrought.Todeterminetheperoxidas'activityinthedroughttreatmentafterthethirdday,thesixthdayandtheninthday,andusetheguaiacolcolorimetric,Spectrophotometerat470nmwavelengthtomeasuretheresultantcontent,taketheODchangesinthevalueperminuteastheenzymeactivitysize.Theresultsshowedthatthericeperoxidaseactivityenhancedovertimeunderthedroughtconditions,whproIongeddroughtintime,theperoxidaseactivityofthegrowthrateslowsdown.
Keywords:
droughtconditions;peroxidase;wheat
1.前言-1-
1.1中国淡水资源现状-1-
1.2研究小麦干旱的意义-1-
1.3植物体内过氧化物酶的作用-2-
2.实验设计-2-
2.1实验材料与方法-2-
2.1.1实验材料-2-
2.1.2小麦种子的萌发-3-
2.1.3Hoagland培养液的配置-3-
2.1.4小麦幼苗的培养与处理-3-
2.1.5试剂的配置-3-
2.1.6粗酶液的提取-4-
2.1.7酶活性的测定-4-
2.2结果与分析-4-
2.2.1实验数据-4-
2.2.2实验结果-5-
2.2.3结果分析-5-
2.2.4讨论-6-
3.结论-6-
参考文献-7-
致谢错误！
未定义书签。
丄、F亠一—
1.刖言
1.1中国淡水资源现状
随着全球温室效应的加剧和生态平衡的破坏，干旱已成为全人类面临的一个严重生态问题。
早在1972年,联合国就在“人类环境”全球会议上向全世界发出警告：
水即将成为继石油危机之后的一项严重的社会危机。
1992年,联合国
发布的《二十一世纪议程》提出“：
水不仅是地球上的一切生命所必需，而且对一切社会经济部门都具有生死攸关的重要意义”。
同发达国家相比，中国水危机状况尤其严重。
中国人均水资源占有量仅为2900m3,不足世界平均水平的1/4,居世界第109位，属于世界上13个贫水国家之一。
另外，中国水资源不但总量不足,而且时空分布极不均匀,在耕地和人口分别占全国总量的45唏口38%的北方15个省区中,水资源仅占全国的9.7%。
在我国水资源极度紧缺的同时,农业用水浪费又十分严重，灌溉水的利用率只有40%左右，每立方米的粮食生产效率只有1kg左右（与发达国家的以色列相比，以色列的农业用水效率则达到每立方米2.3kg）。
更由于近年来的持续干旱和对水资源的过度开发利用，连
同愈来愈严重的水体污染，不但使工、农业用水和生活用水矛盾日益突出，甚至已酿成如黄河断流、河川断流、海水入侵、地面沉降等生态灾难[1-2]。
已成为这
些地区农业可持续发展的最大障碍。
可以预料，到2030年中国人口达到高峰期
时，为解决16亿中国人口的吃饭生存问题，水危机形势将更加严重。
在此形势下，必须全面实施节水农业和旱作农业，建立农作物（如小麦）抗旱性综合评价体系，进行抗旱育种的基础与应用研究，这是我国农业可持续发展的必由之路。
1・2研究小麦干旱的意义
小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一。
经过长期的发展，已经成为世界上分布最广、面积最大、总产量第二、贸易额最多、营养价值最高的粮食作物之一。
全世界有43个国家，有35%-40%的人口以小麦为主要粮食。
小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素B，是一种营养丰富、经济价值较高的商品粮，并且随着人口数量的增加，人们对小麦的需求量也在不断增加。
所以了解小麦在干旱胁迫下的反应机制对培育抗旱小麦品种、提高产量和品质具有重要意义。
目前.小麦抗旱机制
的研究主要集中在形态结构方面，包括根系构型、结构及叶片形态；生理机制方面，包括光合作用、渗透调节、酶及蛋白质含量；分子生物学等方面[3]。
1・3植物体内过氧化物酶的作用
过氧化物酶是生物体内的一种重要的蛋白质，是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，与植物的抗逆性有关，是植物体内重要的保护酶之一⑷，普遍存在于植物各种组织器官中，具有物种组织器官和发育阶段的特异性。
它对环境变化十分敏感，如辐射、重金属、低温、盐胁迫、干旱胁迫等逆境下都会引起酶谱带及活性的变化。
2.实验设计
2.1实验材料与方法
2.1.1实验材料
（1）材料
小麦种子选用豫麦69,属半冬性大穗型中熟品种。
幼苗半匍匐，叶色浓绿,生长势强，抗寒性好（抗冬寒、耐春冻）。
（2）仪器
紫外分光光度仪、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器、移液枪、烧杯、量筒、试管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、移液管、剪刀。
（3）试剂
20mmol/LKH2PO4溶液、PH6.0磷酸缓冲液（附表2.1）、愈创木酚、30%过氧化氢溶液、Hoagland培养液、0.2%KMnO4溶液、石英砂。
表2.1磷酸缓冲溶液
PH
X
Y
PH
X
Y
3.0
46.5
3.5
4.8
23.0
27.0
3.2
43.7
6.3
5.0
20.5
29.5
3.4
40.0
10.0
5.2
18.0
32.0
3.6
37.0
13.0
5.4
16.0
34.0
3.8
35.0
15.0
5.6
13.7
36.3
4.0
33.0
17.0
5.8
11.8
38.2
4.2
31.5
18.5
6.0
9.5
40.5
4.4
28.0
22.0
6.2
7.2
42.8
4.6
25.5
24.5
xmLA
+ymLB，
稀释至200mL
贮备液A:
0.2mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O27.6g配成1000mL）。
贮备液B:
0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO47H2O53.65g或Na2HPO412H2O71.7g配成1000mL）⑸。
2.1.2小麦种子的萌发
播种前，将种子与沙子用0.2%KMnO4溶液浸泡消毒十五分钟，流水冲洗10min，然后将种子置于25C环境下浸泡24h,最后置于25C的恒温培养箱培芽24h。
2.1.3Hoagland培养液的配置
（1）大量元素的配置：
称取四水硝酸钙0.945g、硝酸钾0.506g、硝酸铵0.08g、磷酸二氢钾0.136g、硫酸镁0.493g，将药品放入烧杯中溶解，然后用1000ml容量瓶定容。
（2）铁盐溶液的配置：
称取七水硫酸亚铁2.78g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na）3.73g置于扫杯中溶解后用500ml容量瓶定容。
pH=5.5
（3）微量元素液的配置：
称取碘化钾0.83mg、硼酸6.2mg、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钻0.025mg,将药品置于烧杯中溶解后用1000ml容量瓶定容。
（4）向配置好的大量元素溶液中加入2.5ml的铁盐溶液、5ml的微量元素溶液，混合均匀，调整溶液PH=6.0，所得溶液既为Hoagland完全培养液。
2.1.4小麦幼苗的培养与处理
将萌发一致的种子播于装有消好毒的沙子的盘中，置于普通环境下培养，每天浇灌适量
水，每两天浇灌适量Haogland营养液。
待小麦长到第十天时，将幼苗分为正常对照组和持续干旱组，持续干旱组小麦停止加水，正常组不变。
干旱处理后的第3天、6天、9天分别
对干旱组和正常组小麦进行过氧化物酶活性测量。
2.1.5试剂的配置
（1）20mmol/LKH2PO4试剂的配制：
称取2.72gKH2PO4置于烧杯中溶解，然后用1000ml容量瓶定容。
（2）PH6.0的磷酸缓冲液的配置:
1称取NaH2PO42H2O31.2g,置于烧杯中溶解，然后用1000ml容量瓶定容。
2称取Na2HPO412H2O71.7g,置于烧杯中溶解，然后用1000ml容量瓶定容。
3取87.7ml贮备液A,12.3ml贮备液B混匀，稀释成200ml,配制成PH为
6.0的磷酸缓冲液。
（3）反应混合液的配置：
取100mmol/LPh6.0磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28uL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀，保存于冰箱中。
2.1.6粗酶液的提取
称取1g正常小麦材料，放入加石英砂的研钵中，加入5ml20mmol/LKH2PO4溶液，研磨成匀浆，以4000r/min离心15min,收集上清液保存在冷处，残渣再用5ml20mmol/LKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液⑹。
干旱处理的小麦粗酶液的提取过程和正常处理的小麦的提取过程相同。
2.1.7酶活性的测定
取两只光径1cm的比色杯，一只加入反应混合液3ml,20mmol/LKH2PO41ml作为较零对照；另一只加入反应混合液3ml，正常处理的小麦粗酶提取液1ml（如酶活性过高可适当稀释），立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测量OD值，没隔一分钟读数一次。
以每分钟OD变化值表示酶活性大小。
干旱
处理的小麦POD活性的测定的过程和正常处理的小麦的测定过程相同。
2.2结果与分析
2.2.1实验数据
每分钟OD值
1
2
3
4
5
正常
0.547
1.246
1.675
1.942
2.141
第三天
干旱
0.423
0.878
1.134
1.331
1.522
第六天
正常
0.314
0.806
1.287
1.657
1.964
干旱
0.436
0.851
1.387
1.608
1.787
正常
0.510
1.275
1.693
1.987
2.297
第九天
干旱
0.326
0.788
1.314
1.525
1.724
222实验结果
酶活性U=△ODXD/0.01WXt。
［△OD为反应时间内吸光度的变化值；
W为植物鲜重；t为反应时间（1min）;D为稀释倍数，酶活单位为U/（gFW?
min）;0.01为一个过氧化物酶活性单位］⑺。
「旱条件下小麦POD活性变化
000000000
OOOOOOOO
64208642
111111
u二Il.MJM）、n艺熔戟KQE
□正常组
■干早组
2.2.3结果分析
由图表干旱组与正常组的对比可知，经干旱处理后，小麦幼苗的POD活性增强，甚至是成倍的增强。
通过干旱组之间的对比可知，小麦干旱处理的前6
天,小麦幼苗POD活性增强的速率较快，第6天以后，小麦幼苗的POD活性虽然也有所增加，但速率明显下降。
根据氧自由基伤害学说，干旱胁迫会使小麦体内氧自由基的的含量增加，进而破坏氧自由基原本低水平的动态平衡，引起细胞膜脂质过氧化.细胞膜通透性发生变化，细胞器甚至整个细胞的结构都会受到破坏。
过氧化物酶是植物酶促反应体系的保护酶，它可以防御活性氧对植物细胞的伤害，以减轻干旱对小麦幼苗的伤害［8-10］。
在干旱初期，小麦细胞体内活性氧增加，为了防御活性氧对细胞的伤害，小麦细胞内的POD活性增强；但随着干旱时间的延长，小麦体内活性氧的含量越来越多，进而破坏了小麦体内保护酶系统（过氧化物体）的活力和平衡，最后使得PO的活性增强受到抑制。
2.2.4讨论
植物在正常的生理条件下，体内的氧自由基是处于低水平的动态平衡状态，而在干旱条件下，氧自由基的动态平衡遭到破坏，进而使细胞遭受伤害，而POD
可以防御活性氧对细胞的伤害。
在活性氧的代谢过程中，PO可催化NADH或NADPH氧化成O，进一步被歧化为H202和分子氧［11］。
H202是一种相对稳定的分子，在PO催化下转变成对细胞无害的HC和02。
PO活性增强可缓解干旱胁迫造成的氧化性损伤•减轻对细胞膜的破坏•这是生物体的一种适应性反应。
但PO活性的
增强并不能完全阻止干旱对小麦的伤害，所以POD活性增加的速率会随干旱时间的延长而降低。
从实验结果来看，酶活性的变化符合氧自由基伤害学说，体现了POD作为一种保护酶的功能。
通过对干旱条件下小麦POD活性的研究，对筛选小麦抗旱品种有一定的指导意义。
当前小麦抗旱性研究的相关趋势是从实验室到农田的转移,从小麦的单个时期到整个生活周期的延伸，从研究一个基因到探索多个基因的功能超过几百的过度。
伴随着基因库和基因芯片在小麦抗旱性领域的普遍应用转基因小麦种植面积的不断扩大，小麦抗旱性研究将取得重大突破［12］。
3.结论
过氧化物酶是植物体内的一种重要保护酶，与植物的抗逆性有关。
在干旱条件下，小麦过氧化物酶的活性增强。
但干旱到一定程度时，POD酶活性即受到
抑制而增长变慢。
发生这种现象的原因可能是干旱脱水严重时，POD酶结构受
到影响，活性中心构象遭到破坏或障碍，从而使酶活性下降。
本研究证实从一定干旱处理时间的POD酶活性变幅大小上可以判断小麦抗旱性大小。
这样，POD酶活性可以作为评价稻品种抗旱性的指标之一。
参考文献
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⑹张志良，李小方.植物生理学实验指导第四版[M]北京中国教育出版社2009.7:
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