酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化设计+开题+综述.docx
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酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化设计+开题+综述
开题报告
食品质量与安全
酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化
一、选题的背景与意义
胶原蛋白，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白。
由于胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而其被广泛的应用于化工、食品、医学、生物材料以及农业等诸多领域。
因此，胶原蛋白的提取一直是研究的热点。
目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。
相对于我国，其在胶原蛋白的基础研究上已经具有一些优势并拥有一定的国际专利，而且部分已经投入市场，形成一定的市场规模。
而我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。
但就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。
另一方面在肉制品和制革加工过程中含有丰富胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低。
这样既浪费资源又污染环境，利用这些废弃物生成胶原蛋白实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。
本实验的以牛肉制品的下脚料——牛皮为原料，利用酶解法提取胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：
基本内容：
1、对牛皮成分的测定：
主要测其水分、脂肪、粗蛋白、胶原蛋白等。
2、酶制剂的选择和复合：
选择两种胶原蛋白提取率比较高的酶，然后按一定比例进行复合试验。
3、研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响：
通过对加酶量、水解pH、水解温度、水解时间、固液比等因素进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验得出优化的工艺条件。
拟解决的问题：
1、如何选择合适的比例对两种单酶进行复合。
2、如何提高胶原蛋白的提取率。
三、研究的方法与技术路线：
研究的方法：
1、牛皮成分测定：
水分测定采用直接干燥法；脂肪测定采用索式提取法；蛋白质测定采用凯式定氮法；胶原蛋白的含量测定采用羟脯氨酸法
2、酶制剂的酶活力测定：
采用福林酚法。
3、胶原蛋白的提取：
⑴预处理：
去脂采用丙酮法，去除其他非胶原成分采用5%的NaCl。
⑵胶原蛋白测定：
采用羟脯氨酸测定法。
4、条件优化方面：
采用单因素实验法和正交实验法
技术路线：
牛皮→预处理→酶提→测定
四、研究的总体安排与进度：
1、2010年10月至2011年12月：
实验前的准备工作；查阅相关的文献，完成开题报告、任务书及文献综述。
2、2011年1月至2011年4月：
实验研究阶段。
⑴对牛皮成分的测定
⑵酶制剂的选择和复合
⑶研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响
3、2011年4月至2011年5月：
整理实验阶段，并完成毕业论文。
五、主要参考文献：
[1]廖艳阳.胶原蛋白的研究进展[J].长沙大学学报,2009,23（5）:
36～38
[2]Kharagpur.Fishcollagen:
APotentialMaterialForBiomedicalApplication[J]IEEE,2010,34～38
[3]王丽珍、黄素珍.胶原蛋白的研究进展[J].肉类研究,2010,131:
16～22
[4]郭文宇、代敏、杨丽红等.水生动物与陆生动物皮胶原特性及应用前景[J].中国皮革,2007,36（17）:
55～57
[5]郭恒斌、曾庆祝.水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用[J].农产食品科技,2007,1（3）:
46～50
[6]郭玉华、刘扬瑞、李钰金.鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展[J].中国食品添加剂,2010,3:
175～179
[7]肖高、施亦东、陈衍夏.胶原蛋白的提取及其对纺织材料的改性研究[J].丝绸,2010,2:
5～9
[8]胡立新、程骄、占稳等.鱼下角料中胶原蛋白的提取及应用[J].化学与生物工程,2009,26
（2）:
7～9
[9]金桂芬、裘俊红.海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究[J].浙江化工,2008,39（7）:
5～10
[10]周玉惠、页正涛、肖立芳等.猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征[J].湖北大学学报,2008,30（3）:
287～289
[11]王川、李燕、马志英等.几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究[J].食品科学,2007,28
（1）:
201～205
[12]肖世佳、但年华、曾睿等.从动物皮中提取胶原蛋白的方法[J].西部皮革,2009,31（15）:
17～21
[13]刘霞.鱼鳍和鱼鳞中胶原蛋白的提取[J].湖南农机,2008,3:
146～147
[14]吴缇、陈舜胜.鱼皮胶原蛋白的制备及性能研究[J].内陆水产,2008,9:
34～37
[15]钟朝辉、李春美、顾海峰等.草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的提取及基本特性[J].水产科学,2007,26（3）:
91～94
[16]陈小娥、方旭波、钟秋琴.安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺[J].食品工业科技,2007,28（3）:
131～133
[17]王晨、吴晖、李晓凤等.胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究[J].现代食品科技,2008,24（12）:
1300～1303
[18]DefuLi,ChangdaoMu,SumeiCaie.at.Ultrasonicirradiationintheenzymayicextractionofcollagen[J].UltrasonicsSonochemistry,2007,16:
605～609
[19]卢晓林.胶原蛋白在医学中的应用研究现状[J].口腔医学研究,2009,15（6）:
806～808
[20]ChiH.Lee.Anujsingla,YugyungLee.Biomedicalapplicationofcollagen[J].InternetofPharmaceutic,2001,221:
1～22
[21]王丹.胶原蛋白在食品工业中的应用[J].农产食品科技,2009,3
（2）:
48～50.54
[22]李兴武、章黎黎.胶原蛋白的改性研究及在食品工业中的应用[J].肉类研究,2009,11:
80～84
[23]曹荣安、李浩、李良玉.胶原蛋白的生理功能特性及其应用[J].肉类工业,2010,345:
7～9
[24]苏媛媛、刘飞宏.鱼鳞中胶原蛋白的利用价值[J].企业技术开发,2009:
154
[25]王志杰、彭立新.胶原蛋白的提取及其配吵纸张的物理性能[J].纸和造纸,2006,25（5）:
35～36
[26]王元荪.从牛制革废皮边角料中提取未变性天然胶原[J].明胶科学与技术,2008,28（3）:
125～128
[27]张莹、魏玉娟.废革屑提取胶原蛋白的研究[J].中国皮革,2008,37（5）:
36～40
毕业论文文献综述
食品质量与安全
酶解法提取胶原蛋白的研究进展
摘要：
胶原蛋白是一种重要的功能性多糖蛋白质。
因具有良好的物理性能和生物学特性在医学、食品、美容保健等许多领域有着广泛的应用。
因此胶原蛋白的提取一直是研究的热点。
而酶提取法是目前比较理想的手段。
本文介绍了酶提取法相较其他几种提取法的优点，并阐述了酶提取法的工艺流程以及在工艺条件上的研究，最后指出了目前胶原蛋白的应用状况。
关键词：
胶原蛋白；提取；酶解法；应用前景
ResearchProgressAboutTheenzymaticExtractionOfCollagen
Abstract:
Collagenproteinisakindofimportantfunctionalpolysaccharideprotein.Duetoitsfavorablephysicalandbiologicalcharacteristics,collagenhasawiderangeofapplicationsinmanyareas.Thereforethecollagenextractionhasbeentheresearchfocus.Andenzymeextractionistherelativelyidealmeans.Thisessayexpoundstheadvantagesofenzymaticextractionofcollagecomparedwithotherextractionmethods.Thenintroducestheenzymaticextractionprocessandtheresearchinthetechnologicalconditions.Finally,itpointsouttheapplicationprospectsofcollagen.
Keyword:
collagen;extraction;enzymaticextraction;applicationprospects
1前言
胶原蛋白是哺乳动物内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质，占人体内蛋白质总量的25%~30%，相当于体重的6%。
胶原蛋白是一种重要的功能性多糖蛋白质，与细胞再生、分化、运动、免疫、关节润滑、血压抑制、伤口愈合、衰老及疾病等有极其密切的关系。
同时由于胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并具有低免疫原性和良好的生物相容性。
结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。
其应用领域涉及医药、化妆品、食品等多个分支[1～3]。
从19世纪40年代，Orekjovich等应用枸椽酸缓冲液从大鼠皮肤中溶解出与角蛋白、弹性蛋白同类的不溶性蛋白-胶原蛋白，翻开了胶原研究的篇章[4]以来到现在，对胶原蛋白的研究不断增多。
而胶原蛋白的提取一直是研究的热点。
2胶原蛋白的提取方法研究
2.1提取方法的比较
胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。
迄今为止，依据提取介质的不同，胶原蛋白的提取方法可分为五类，即热水浸提法、酸法、碱法、盐法以及酶法等[5]。
热水提取法是原料经过各种预处理后，在一定条件下用热水抽提而得到水溶性胶原蛋白的方法。
此法提取率高，但是所得的胶原蛋白已经不具有胶原蛋白的三螺旋空间结构。
酸法提取主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐碱和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解。
酸法提取比较迅速而且彻底，但色氨酸全部被破坏，且产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。
碱法提取是用碱溶液预处理后的材料，从而达到提取胶原蛋白的目的。
碱法提取也较迅速彻底，但是含羟基和硫基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用，很难保留胶原蛋白的三股螺旋结构。
因此，现代工业一般不采用此种方法。
盐法是利用各种不同的盐在不同的浓度下提取盐溶性胶原蛋白的方法。
但是其溶解和分级受中性盐效应影响。
有的盐可以维持胶原蛋白的稳定性，而有的则可降低其构象稳定性，从而对提取天然胶原蛋白很不利。
酶法提取是利用各种不同的酶主要是各种蛋白酶在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白。
由于胶原蛋白的三股螺旋结构对胃蛋白酶具有相当的稳定性。
因此酶提取法对胶原蛋白破坏性小，能更好更完全地得到活性蛋白，同时其具有较高的回收率，无环境污染，。
利用该方法提取胶原蛋白不仅能满足一些领域对胶原蛋白结构的特殊要求，而且符合当今生态化提取胶原蛋白的要求[6~8]。
金桂芬等人[9]对于海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究中，发现采用酸法和酶法分别提取胶原蛋白，发现酶法提取可获得较高含量的胶原蛋白，并且胶原蛋白的纯度较高。
周玉慧[10]等人采用较简单的酶法从猪皮中提取胶原蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳、紫外光谱定性分析表明胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，即具有生物活性。
如今生物技术水平不断地提高，酶制剂来源广泛，活性不断提高，价效比也大幅度地降低，在酶法提取胶原蛋白显示了其他方法无法比拟的优越性。
因此，目前用酶法提取胶原蛋白是比较理想的手段。
2.2酶的选择
能用于提取胶原蛋白的酶有很多。
按照来源上可以分为植物蛋白酶（如菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶等）、动物蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）、微生物蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶等）。
根据酶的性质，又可以分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶及碱性蛋白酶。
由于各种酶之间存在差异性，单用一种酶往往会存在一些不足。
王川等人[11]用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶三种酶从猪皮中提取胶原蛋白的研究中发现，胰酶得率最高，可操作性强，但相对其他两种结构破坏较严重；胃蛋白酶的结构保持了最大的完整性，分子量在10万Da左右。
但得率是三种酶中最低的。
木瓜蛋白酶的得率和结构都介于两者之间[9]。
因此在实际操作中，大多数采用复合酶来提取胶原蛋白。
3酶法提取胶原蛋白的工艺条件研究
3.1酶法提取胶原蛋白的工艺流程
酶法提取胶原蛋白的一般工艺为：
预处理→酶解→盐析→透析→冷冻干燥[12]。
预处理一般是除去皮源中不同杂志，如钙物质、脂肪等，以便后续操作，得到更多更纯的胶原蛋白。
酶解过程主要是在预处理的原料中加入酶制剂等，在一定的反应条件，酶解一定时间的，将原料中胶原蛋白提取的过程。
在这个过程中，由于原料的性质不同或者所选用的酶特性，可能在加入酶制剂的同时在加入其它的辅助试剂，例如采用胃蛋白酶做为酶制剂中，需要加入酸性介质，一般采用加入乙酸。
刘霞[13]对鱼鳍和鱼鳞中胶原蛋白的提取中，采用柠檬酸做为介质，并与乙酸做比较，发现柠檬酸的提取效果更好。
而后面的几个步骤主要是对胶原蛋白进行分析、纯化和保存。
一般是通过加氯化钠进行盐析，然后用将得到的蛋白液移入透析袋进行透析，最后对得到的胶原蛋白进行冷冻干燥进行保存。
在这个过程也包括一些过滤、离心、溶解等过程。
3.2酶法提取胶原蛋白的工艺条件
采用酶法提取胶原蛋白时，必须严格控制提取条件。
影响酶提取法的因素很多，主要包括酶的用量、水解pH、水解时间、水解温度等[8]。
例如水解温度对胶原蛋白的影响[12，14]。
目前国内采用酶法提取胶原蛋白时的水解温度基本在50℃以上或4℃以下，而胶原蛋白在37～38℃以上就会变性，生产明胶[11]。
钟朝辉[15]等人在研究草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的提取及基本特性中发现用DSC测定草鱼鱼鳞PSC冷冻干品的变性温度时，PSC在37.1℃时存在吸热峰，表明此时胶原蛋白结构被破坏而发生变性。
故较高温度下的提取物为变性胶原，其进一步应用受到限制。
低温下虽然有助于胶原结构的完整，但酶解时间长[12]。
而胶原的结构对于其在医学、保健等方面的应用有很大的影响，但在造纸工业以及制革工业等领域，胶原蛋白的结构对其影响相对较小。
因此，温度的选择要根据胶原蛋白产品的最终用途相结合。
同时又由于这些因素既是相辅相成，又是有主次的影响之分，所以在研究中需要总体考虑。
也因为其的复杂性，对酶提法的工艺条件优化成为很多学者的研究对象。
陈小娥等人[16]在对安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺研究中，进行了最佳酶处理条件的确定，主要是对最佳胃蛋白酶添加量、最佳料液比、最佳酶解时间、最佳酶解温度的确定，通过单因素实验和正交实验最后得到安康鱼皮胶原蛋白的最佳处理条件为：
胃蛋白酶质量分数为1%，料液比为1:
10，酶解时间为6h，酶解温度为5℃，最后平均提取率为11.01%，纯度为96.5%。
王晨[17]等人以干鸡骨粉为原料，研究了用胃蛋白酶提取胶原蛋白的酶法提取工艺。
得出的最佳酶解工艺为：
加酶量150U/g，pH值为1.7、37℃条件下处理120min,然后在固液比6:
1的情况下用水抽提5h.在上述条件下，提取率可达18.4%。
此外，一些研究者还通过添加在酶提取中加入其他的处理来提高胶原蛋白的提取率等。
DefuLi等人[18]在研究超声波对酶提取提取胶原蛋白的影响中发现，利用超声波照射后，胶原蛋白的提取率明显提高，大约是未进行超声波照射的124%，而且缩短了提取的时间。
4胶原蛋白的应用前景
胶原蛋白由于无毒、无致畸、无突变性能，生物相容性好，并在体内可以降解成无毒天然产物，在医学领域应用前景关阔，目前主要作为凝血材料、组织工程材料、药物载体材料和充填材料等[19~20]。
同时胶原蛋白具有紧密的螺旋结构从而显示出很强的任性和强度，氨基酸组成又使其具有优良的成膜能力，在食品行业保健行业被广泛应用，主要作为功能保健食品、食品添加剂、食品包装以及涂层材料等[21~22]。
而且从动物皮重提取的胶原蛋白中还含有透明质酸、硫酸软骨等蛋白多糖，它们含有大量极性集团，是保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用，可广泛应用于美容、美肤、美发用品中[23]。
另外由于胶原蛋白独特的宏观物理特性，用于相纸定片、纺织、造纸等领域[7。
24~25]。
正由于胶原蛋白在各个领域的应用前景广阔，因而它对胶原蛋白的提取也提出了更高的要求。
胶原蛋白的提取既要做到高产率、清洁化的生态化提取，也要最大程度上保留胶原蛋白的生物学性能。
参考文献
[1]廖艳阳.胶原蛋白的研究进展[J].长沙大学学报,2009,23（5）:
36～38
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[24]苏媛媛、刘飞宏.鱼鳞中胶原蛋白的利用价值[J].企业技术开发,2009:
154
[25]王志杰、彭立新.胶原蛋白的提取及其配吵纸张的物理性能[J].纸和造纸,2006,25（5）:
35～36
本科毕业设计
（20__届）
酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化
0前言1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1原料来源2
1.1.2酶制剂2
1.1.3仪器与设备2
1.1.4试剂2
1.2测定方法2
1.2.1酶活的测定2
1.2.2牛皮中胶原蛋白含量的测定2
1.3工艺流程3
1.4操作要点3
1.4.1原料预处理3
1.4.2酶法提取牛皮胶原蛋白3
1.5试验方法4
1.5.1酶及提取介质的选择4
1.5.2复合酶的复合比确定4
1.5.3酶提取的单因素实验4
1.5.4酶提取的最佳工艺条件正交实验4
2结果与分析5
2.1牛皮中胶原蛋白含量的测定结果5
2.1.1羟脯氨酸标准曲线的绘制5
2.1.2牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果5
2.2酶活测定结果6
2.3酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响6
2.4复合酶的不同复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响7
2.5酶提取的单因素实验结果7
2.5.1料液比对牛皮胶原蛋白提取率的影响7
2.5.2酶提时间对牛皮胶原蛋白提取率的影响8
2.5.3酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响9
2.5.4加酶量对牛皮胶原蛋白提取率的影响10
2.5.5乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响10
2.6酶提取的最佳工艺条件正交实验结果11
3结论12
致谢12
参考文献12
附录14
摘要：
胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而应用于化工、食品、医学等诸多领域。
本文以牛肉制品的下脚料——牛皮为原料，以胶原蛋白提取率作为指标，比较水和0.5mol/L的乙酸溶液两种不同的介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，得出采用酸酶结合法更利于牛皮胶原蛋白的提取。
此外，在酶的选择上通过比较试验，最后选择复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按1:
1酶活比例复合）作为试验用酶。
在此基础上，本实验又通过单因素试验和正交试验对牛皮酶解工艺条件进行了优化，实验结果表明酶提取的最优条件为：
以0.5mol/L的乙酸溶液为提取介质，料液比（m/V）为1:
25，酶提温度为42℃，酶提时间为8h，加酶量为3000U/g，牛皮胶原蛋白的提取率高达90.56%。
关键词：
牛皮；酶解；胶原蛋白；复合酶
Abstract:
Duetocollage’smanyfavorablephysicalandbiologicalcharacteristics,ithasawiderangeofapplicationsinmanyareas.Inthispaper,freshcowhideasrawmaterialandtheextraction
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