Total RNA的提取.docx
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TotalRNA的提取
一.TotalRNA的提取
1.试剂配制
准备工作:
1,研钵,5ml/10ml/25ml移液管,100ml/250ml量筒,250ml/100ml容量瓶,药匙,试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时.
2,50ml/1.5ml离心管,枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃20mins高压灭菌.
电泳槽及电泳托,梳子用3%双氧水处理.
4,常用试剂及其配方:
▲DEPC水:
在1000ml去离子水中加入100ulDEPC,静置过夜后高压灭菌.
▲0.78M柠檬酸纳:
PH=4~5
三水合柠檬酸纳22.94g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.
▲10%肌氨酸钠:
肌氨酸钠10g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.
▲变性裂解液:
0.78M柠檬酸钠8.25ml
10%肌氨酸钠12.375ml
异硫氰酸胍118.05g
加DEPC水定容至250ml,室温放置备用
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）
▲2M醋酸钠PH=4.5
NaAc·3H2O13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
▲3M醋酸钠PH=5
NaAc·3H2O20.4g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
4MLiCL:
LiCL24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用
▲0.5MEDTAPH=8.0
EDTA18.61g
用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用
▲10XMOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）:
MOPS41.86g
NaAC·3H2O4.10g
0.5MEDTA（PH8.0）20ml
用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L,室温避光放置备用.
1xMOPS:
10xMOPS30ml
加DEPC水270ml,用时现配.
▲4xRNALoadingbuffer:
10xMOPS400ul
甘油（高压过）200UL
溴酚兰10ul
甲醛（37%）72ul
去离子甲酰氨310ul
EDTA（0.5MPH8.0）8ul
ErBr（10mg/mlinDEPCH2O）70ul
在4℃可保持3个月
10xPBS
pH=7.4
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g
KH2PO42.4g
定容至1000ml
▲变性电泳胶:
称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml1xMOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上.
▲变性电泳缓冲液:
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1xMOPS定容至250ml
2.动物组织totalRNA的提取
根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟.
将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片.
根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0）,反复颠倒混匀4-5次.
根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.
冰浴10分钟.
4C,12000g离心20分钟.
小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA.蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层.
加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上.
4C,12000g离心20分钟.
根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA.
加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.
4C,12000g离心20分钟.
小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟.
4C,12000g离心20分钟.
弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀.4C,12000g离心10分钟.
弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味.用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀.
取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存.
表1
Mg#oftissue
500
800
1000
变性裂解液（ml）
5
8
10
2MNaOACpH4（ml）
0.5
0.8
1
水饱和酚（mL）
5
8
10
氯仿（mL）
1
1.6
2
异丙醇（mL）
4
6
8
变性裂解液（mL）
0.5
0.8
1
异丙醇（mL）
0.5
0.8
1
75%乙醇（mL）
1
1
1
DEPC-treatedH20（mL）
0.5
0.8
1
3.植物组织totalRNA的提取
先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状.
将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆.（1g样品加入3ml变性裂解液）.
加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4-5）颠倒混匀.
加入3ml（等体积）的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml（1/3）的氯仿,振荡.
冰浴10min.4℃,12000g离心10min
小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时.
4℃,12000g离心20min.
去上清,取沉淀.加1ml4M的LiCl溶解沉淀（1mlLiCl/g组织）,并转入1.5ml离心管中.
4℃,13000rpm离心15min.
用0.4mlDEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀.
4℃,13000rpm离心10min.
取上清,加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上.
4℃,13000rpm离心15min.
弃上清,用1ml75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min.
弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味.
用40-60ulDEPC水溶解（300-500ug/g）RNA沉淀.
取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存.
4.TRIzolReagent提取totalRNA（GIBCO）
查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%.
将组织样品放入TRIzolReagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片.
3.室温温育10分钟.
据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟.
4C,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%.
转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中.根据表2加入适量异丙醇,-20C沉淀1小时以上.
4C,12000g离心10分钟.
去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀.
4C,7500g离心5分钟.
去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干.加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀.
取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80C冰箱中保存.
表2
组织量
TRIzolReagent
氯仿
异丙醇
75%乙醇
50~100mg
1ml
0.2ml
1ml
1ml
二.mRNA的分离
1.OligotexmRNAKits（QIAGEN）法
准备工作:
1.将OligotexSuspension置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex.,然后置于室温.
2.将OBBBuffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温.
3.将OEBBuffer置于70℃水浴中,待用.
试验步骤:
表3:
加入试剂量据此表
TotalRNA
RNase-freeWaterto:
BufferOBB
（ul）
Oligotex
Suspension（ul）
Prepsize
<=0.25mg
250ul
250ul
15
Mini
0.25-0.5mg
500ul
500ul
30
Midi
0.5-0.75mg
500ul
500ul
45
Midi
0.75-1.00mg
500ul
500ul
55
Midi
TotalRNA量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-freewater补足到500ul
根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension,轻弹1.5ml离心管彻底混匀
置于70℃水浴中3min
取出置于室温（20℃-30℃）10min
13000rpm室温离心2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上.
用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到SpinColumn中,RT,13000rpm,离心1min
将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中,加400ulOW2,RT,13000rpm,离心1min
将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中,取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min.
取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min.
测OD,并电泳定量.
2.磁珠法分离mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.65C加热10分钟.
3.加入3ul生物素标记的Oligo（dT）和13ul20×SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10分钟左右.
4.同时配0.5×SSC1.2ml和0.1×SSC1.4ml.
5.将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec）,小心去上清,切不可离心.用0.3ml0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次.
6.将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用.
7.将（3）中的oligo（dT）/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10分钟.
8.用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清,但不要弃去.
用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.
将SA-PMPs重新悬浮在0.1mlRNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA.
用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中.
将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中,洗脱,与（11）步洗脱液合并.
将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）.
加0.1体积的3mol/lNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20C沉淀过夜.
4C,13000g离心60分钟.去上清,加入500ul70%乙醇混匀.
4C,7500g离心10分钟.
去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解.
重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项:
1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行
2.如果totalRNA质量高,杂质少,就选择Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法.
3.mRNA的电泳图是smear.
三.cDNA双链合成
1.SupersciptII—RT合成第一链:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入
xulmRNA（大约500ng）
1ulXhoIPrimer（1.4ug/ul）
（5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3'）
11-xulRNase-freewater
（大于500ngmRNA分n管（500ng/tube）合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2.混匀后,70℃反应10分钟;
3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul5×firststrandbuffer
2ul0.1MDTT
1ul10mMdNTP（自己配制）
混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
反应完成,趁热加入1ulSupersciptII—RT,混匀;
42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2.cDNA第二链的合成:
1.第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测.其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂（promega）:
20ul10×DNAPolymeraseIbuffer
6ul10mMdNTP（自己配制）
xulddH2O
1ulRNaseH（2U/ul）
10ulDNAPolymeraseI（10U/ul）
总体系为200ul;
2.混匀后,16℃反应2.5小时;
3.70℃灭活10分钟;
4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定.同时上1kbladder,确定双链的大小范围.
注:
一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些.
3.双链cDNA末端补平:
1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂（promega）:
6ul10mMdNTP
2ulT4DNAPolymerase（8.7U/ul）
2ulBSA（10mg/ml）
2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAc（PH5.2）和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注:
第3,第4步可以用PCR纯化试剂盒代替.
PCR纯化试剂盒操作流程:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀.
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB,混匀.
3.加入spincolumn中,13000rpm离心1min.
4.加入0.75mlbufferPE,13000rpm离心1min.
5.13000rpm,再离心1min.
6.将spincolumn放入一新的离心管中,加入50ulbufferEB,静置10min.
7.13000rpm离心2min.
8.加入30ulbufferEB,静置10min.
9.13000rpm离心2min.
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜.
4EcoRIadaptor加接:
1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor（400ng/ul）,4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul10×LigaseBuffer
1ul10mMrATP
1ulT4DNALigase（4U/ul）
3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNALigase;
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul10×LigaseBuffer
1ul10mMrATP
6ulddH2O
1ulT4PNK（10U/ul）
3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4.稍微离心使反应物集中至管底;
5.室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ulXho10×Buffer
2ulBSA
5ulddH2O
8ulXhoI（10U/ul）
6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7.反应完成,双链cDNA合成完毕.置于4℃准备回收.
6.胶回收cDNA（QIAEXIIGELExtractionKit回收试剂盒）
配制小胶数板（每个样品一板）:
1%琼脂糖凝胶,2ulEB/300ml胶
取4℃保存样品上样,40ul/孔.
3.电泳50V;1hr
4.紫外灯下分别切下500~1kb,1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中.
称取胶重,加入三倍体积bufferQXI（例如,100mg胶中加入300ulbufferQXI）
50℃水浴数分钟,至胶完全融化.用手指弹QIAEXII使重悬,每管中加入5ulQIAEXII
50℃水浴10min,每隔2min取出颠倒混匀数次,使QIAEXII保持悬浮
4℃,13000rpm,30sec.（弃上清,离心机中甩一下,吸取上清）
加入500ulbufferQXI,轻弹管底使QIAEXII重悬
离心并去上清（同操作8）
加入500ulbufferPE,重悬QIAEXII,离心30sec,去上清
再加入500ulbufferPE,重悬QIAEXII,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清
超净台上吹干（至无乙醇味）,加入10ulelutionbuffer,重悬QIAEXII,静置5min,13000rpm,30sec.吸上清,冰上放置.
取1ul上清上样电泳,同时做分子量标准（1kbladder）及DNA含量标准（10ng,20ng）作对照.
将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接.
注意事项:
1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜.
2.胶回收时电压要稳定.
四.载体制备
1.pBlueScriptII的提取
1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜.
2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10mlAMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜.
3.第三天取200l小摇后的菌液接种于250ml含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6hr左右,使OD值达到0.6-0.8.
4.将菌液移入250ml离心管中,4℃,3000rpm,离心15min.取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干.（注意离心前需配平）
5.加入10ml溶液Ⅰ（50mMGlucose,25mMTris-HCl,10mMEDTA,pH8.0）,加入RNase至终浓度100g/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min.
6.按NaOH（0.4N）:
SDS（2%）--1:
1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min.
注:
静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中.
7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min.
8.4℃,5000rpm,离心15min.
9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀.
10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min.
11.20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀.
12.弃上清,用70%的乙醇洗2次.
13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体.
14.用3mlTE（pH8.0）溶解沉淀,移入1.5mlEppendorf离心管中.
15.电泳检查DNA质量并定量.（必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切.）
2.pBlueScriptII的双酶切消化
1.以如下体系进行EcoRI酶切:
pBSK（+）Xl（6g）
ddH2O174-Xl
10×BufferE20l
混匀,加入限制性内切酶:
EcoRI（10U/l）6l
总体积为200l.
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下.
3.37℃,水浴1hr.
4.加入200ul1:
1的酚/氯仿,混匀.4℃,13000rpm,离心15min.
5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min.
6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min.
7.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.
8.加入200ul70%的乙醇洗沉淀.
9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.
10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ulddH2O充分溶解沉淀.
11.加入以下试剂进行XhoI酶切:
ddH2O74l
10×BufferD20l
混匀,加入限制性内切酶XhoI:
XhoI（10U/l）6l
总体积为200l.
12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下
13.37℃,水浴1.5hr.
14.加入200ul1:
1的酚/氯仿,混匀.
15.4℃,13000rpm,离心15min.
16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min.
17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min.
18.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.
19.加入200ul70%的乙醇洗沉淀.
20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.
21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40ulddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体.
3.载体去磷酸化
1.在40ul双酶切载体中加入以下试剂:
6ul10×buffer
6ulCIAP（0.01U/ul）
8ulddH2O
总体积60ul.
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩
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