第八章 酶通论.docx

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第八章酶通论

酶学研究简史：

酶（enzyme）希腊语原意：

inyeast，生物体内催化化学反应的物质，细胞中的球蛋白多数为酶。

1783年：

Spallamzan发现鸟的胃液能消化肉。

1814年：

Kirchhoff发现稀酸对淀粉的加水分解作用。

并发现麦芽抽提液加入淀粉后能生成麦芽糖，即麦芽抽提液中必定有能水解淀粉的水溶性物质→ferment（酵素）。

1830年：

Kuhle开始使用Enzyme这一术语。

1833年：

Payen&Persoz从麦芽抽提液得到了ferment，称diastase，即现在的amylase。

1835年：

Berzelius提出ferment起的是催化作用。

1857年：

Pasteur认为发酵分几个阶段进行，每一步都有特定的酶参与，但酶只在活体细胞中才能起作用。

1894年：

Bertrand发现了水解酶以外的酶。

1897年：

Buchner兄弟以“没有酵母的酒精发酵”证明了酶可以离开细胞起作用。

1910年：

Halden&Young发现酶是蛋白质与耐热性低分子量化合物（cofactor）的复合物，提出蛋白质只是担体。

1913年：

米氏方程建立。

1926年：

Sumner得到了Urease的结晶，随后，Northrop结晶化了Pepsin，Trypsin等蛋白酶，结晶中测定不到cofactor。

1929年：

Warburg发现呼吸链诸酶中的血红素。

1936年：

维生素与辅酶关系的阐明。

1959年：

SutherlandcAMP的发现→酶与激素的关系。

1970年：

Restrictionenzyme的发现→基因工程。

第一节　酶催化作用的特点

一、酶和一般催化剂的比较

加快反应的速度，但不改变反应的平衡。

二、酶作为生物催化剂的特点

1．易失活

2．具有很高的催化效率

3．具有很高的专一性

4．酶的活性受到调节控制

调节酶的浓度

通过激素调节酶的活性

反馈抑制调节酶的活性

抑制剂和激活剂调节酶的活性

其他调节方式如别构调节

第三节　酶的命名法

一、习惯命名法

二、国际系统命名法

三、国际系统分类法及酶的编号

每种酶的号由4个数字组成，中间用“.”隔开，分别代表大类.亚类.亚亚类.序号，如：

EC1.2.3.2是黄嘌啉：

氧化还原酶的编号。

EC号的第一个数字：

1．oxidoreductase：

氧化还原酶类

2．transferase：

转移酶类

3．hydrolase：

水解酶类

4．lyase：

裂合酶类

5．isomerase：

异构酶类

6．ligase/synthetase：

连接酶类

第四节　酶的专一性

一、酶的专一性

结构专一性

立体异构专一性

二、关于酶作用专一性的假说

锁和钥匙假说；

诱导契合假说；

过渡态互补学说。

第五节　酶的活力测定和分离纯化

一、酶活力的测定

（一）酶活力

酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。

酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。

一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有（如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话），只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。

（二）酶的活力单位

酶活力的大小是以酶单位数表示的。

所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间（秒、分、小时）内反应物的变化量（毫克、微克、微摩尔等）。

酶单位一般有三种表示方法。

1．惯用单位

60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义。

如谷丙转氨酶的改良穆氏法、金氏法和赖氏法的定义以及磷酸酶的布氏法、金-阿二氏法和皮-劳二氏法的定义均不相同，因此正常范围也相差很大，容易造成混乱，有时甚至直接用测得的物理量，如单位时间的吸光度变化（△A/△t）来表示酶单位。

2．国际单位

1961年国际生化学会（IUB）酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU）。

规定一个国际单位（IU）为在实验规定的条件下（如温度为25℃、最适pH、最适底物浓度时），每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。

酶的浓度可以IU/L或IU/mL来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。

如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算。

国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。

但也有不少缺点，如：

①从惯用单位换算成国际单位比较麻烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物（如淀粉酶、胃蛋白酶等），采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数；③同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。

欧美各国由于地理条件及实验室内温度的不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。

3．katal单位

1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal（简称kat），即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为1kat单位。

1kat=60×106IU

1nkat=0.06IU

1IU=16.67nkat

（三）酶的比活力

比活力=活力/mg蛋白

比活力越大，酶的纯度越高。

（四）酶活力的测定方法

酶活力测定就是在一定时间内用分光光度法、荧光法、同位素法、电化学法、生物活性测定法等方法测定产物生成量或底物减少量。

酶活力测定要符合两个原则：

①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与反应时间t成正比；

②反应速度与酶量成线性关系，即

〔E〕=k（-〔s〕/t）=k〔p〕/t

常用的方法有三种：

1．定时法

测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。

因t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一般取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间（t2）后终止反应，如加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。

这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。

缺点是如果不用预试验确定，无法了解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。

因此，用定时法测定酶活力时，应先做预试验来确定线性时间，并在线性时间内进行测定，否则，不能用〔p〕除以t来表示每分钟产生的〔p〕，并用其计算酶活力单位。

2．连续监测法

连续测定（每15s-1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。

定时法只测定两个时间点，而连续监测法则进行多点连续测定。

这种方法的优点是可将多点的测定结果（〔s〕或〔p〕的变化）连接成线，很易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。

也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。

连续监测法测定的结果通常较定时法高，也较为准确，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。

用连续监测法测定的缺点是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器（比色计或分光光度计）必须有保温装置，而且产物（或底物）应是可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物（或产物）有明显差别，否则，需加入其它试剂（如显色剂、酶试剂等），将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。

3．平衡法

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称终点法。

因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。

用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把〔p〕或〔s〕的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。

另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。

但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。

而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。

二、酶的分离纯化

选材

提取

分离纯化

结晶

保存

酶的分离纯化过程中每一个步骤多要测定酶的活力和比活力，计算纯化倍数和回收率。

好的纯化方法应当有较大的纯化倍数和较高的回收率。

纯化倍数=每次比活力/第一次比活力

回收率=每次总活力/第一次总活力

从粘质赛氏菌的粗抽提液提纯天冬酰胺酶的过程。

从粘质赛氏菌的粗抽提液提纯天冬酰胺酶的过程

纯化步骤

总蛋白（g）

总活力

单位

比活力单位

/mg蛋白

纯化

倍数

产量

（回收率）

1

粗抽提液

30

21000

0.7

1

100

2

氯化锰去核酸，热变性

（55℃，5分钟）去杂蛋白

7.64

15017

2.0

2.8

72

3

KOH冰冻融解

5.58

14872

2.7

3.8

71

4

DEAE-纤维素吸附层析

0.113

5025

44.5

63.5

24

5

硫酸铵盐析

0.048

3467

71.7

102.0

17

6

羟基磷灰石吸附

0.016

3133

200.0

286.0

15

7

聚丙烯酰胺凝胶电泳

0.012

3100

255.0

365.0

15

第六节　核酶

一、核酶的概念

1982年发现四膜虫rRNA成熟中RNA的剪接由鸟苷介导。

四膜虫rRNA内含子的5′端切除19个核苷酸即为L19RNA，是最早发现的核酶。

二、核酶的种类

四膜虫核酶的氨酰酯酶活性

三、核酶的研究意义及应用前景

脱蛋白的50S亚基可催化肽键的生成：

第七节　抗体酶

以对硝基苯酚磷酸胆碱酯为半抗原得到的单克隆抗体有酯酶活性；以含有吡啶甲酸的膦酸酯类似物为半抗原得到的单克隆抗体可以水解羧酸酯化合物；以N-甲基原卟啉为半抗原得到的单克隆抗体可以催化平面状卟啉的金属螯合反应。

抗体酶在医学领域有很好的应用前景，也可以说明过渡态互补理论的正确性。

第八节　酶工程简介

一、化学酶工程

（一）天然酶的合理应用

酶类在医药、食品、科研、化工领域的应用及新酶制剂的开发。

（二）化学修饰酶

酶功能基的化学修饰，如酰化反应修饰天冬酰胺酶（抗白血病）可提高其稳定性。

修饰α胰凝乳蛋白酶的表面氨基，增强其亲水性，可提高其热稳定性；交联反应，如α半乳糖苷酶A经交联修饰后稳定性增强；大分子修饰作用，如用葡聚糖修饰α淀粉酶，用聚乙二醇修饰天冬酰胺酶，用肝素、葡聚糖或聚乙二醇修饰尿激酶均可提高其热稳定性。

（三）固定化酶

吸附法；偶联法；交联法；包埋法；固定化细胞；酶电极和传感器。

（四）人工模拟酶

以β环糊精为基础制成的胰凝乳蛋白酶人工模拟酶催化效率与天然酶相似，稳定性较天然酶好。

二、生物酶工程

（一）用基因工程生产酶

已有200多种酶的基因克隆成功，有一些可以高效表达，尿激酶原、tPA等已投入生产。

（二）用蛋白质工程改造酶

用蛋白质工程改造酶，可以改变酶的催化活性、底物专一性、调节功能、对辅酶的要求，可以提高酶的稳定性。

（三）设计新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶

已有明显进展，有广阔的发展前景。