专题1 11 DNA重组技术的基本工具.docx

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专题111DNA重组技术的基本工具

1.1　DNA重组技术的基本工具

学习目标：

1.了解基因工程的概念、诞生及发展。

2.掌握限制酶及DNA连接酶的种类及作用。

（重、难点）　3.理解载体的种类及应具备的条件。

（难点）

一、基因工程及工具酶

1．基因工程的概念

（1）操作场所：

生物体外。

（2）操作技术：

DNA重组和转基因等技术。

（3）操作结果：

赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

（4）操作水平：

DNA分子水平。

2．基因工程的诞生与发展（连线）

①DNA是遗传物质的证明

②基因转移载体的发现

③工具酶的发现A.基础理论

④遗传密码的破译

⑤DNA体外重组的实现

⑥重组DNA表达实验的成功

⑦PCR技术的发明B.技术支持

⑧DNA双螺旋结构和中心法则的确立

提示：

①④⑧—A　②③⑤⑥⑦—B

3．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

（1）来源：

主要来自原核生物。

（2）种类：

约4000种。

（3）特点：

具有专一性，表现在两个方面：

①识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。

②切割——特定核苷酸序列中的特定位点。

（4）作用：

断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（5）结果：

产生黏性末端或平末端。

4．DNA连接酶——“分子缝合针”

种类

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

特点

缝合黏性末端

缝合黏性末端和平末端

作用

缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键

二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

1．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

（1）种类

①质粒：

常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。

②λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。

（2）目的

①将目的基因转运到宿主细胞中去。

②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

（3）必备条件

①在宿主细胞中保存下来并大量复制。

②有多个限制酶切割位点。

③有一定的标记基因，便于筛选。

④对受体细胞无害。

2．重组DNA分子的模拟操作

（1）材料用具：

剪刀代表EcoR_Ⅰ，透明胶条代表DNA连接酶。

（2）切割位点

①分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出G—A—A—T—T—C序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。

②再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。

（3）操作结果：

若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。

1．判断对错（正确的打“√”，错误的打“×”）

（1）基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。

（　　）

（2）DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。

（　　）

（3）DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。

（　　）

（4）限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。

（　　）

（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。

（　　）

（6）DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。

（　　）

（7）载体的种类有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。

（　　）

提示：

（1）√

（2）×　载体是DNA重组技术所需的工具，不是工具酶。

（3）×　DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。

（4）×　限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。

（5）√

（6）×　E·coliDNA连接酶不能连接平末端。

（7）√

2．下列哪项不是基因工程中经常使用的运载目的基因的载体（　　）

A．细菌质粒　　　　　　B．λ噬菌体的衍生物

C．细菌核区中的DNAD．动植物病毒

C　[细菌核区中的DNA是大型环状DNA，不宜做载体；常用载体为细菌质粒、λ噬菌体的衍生物以及动植物病毒等。

]

3．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是（　　）

A．目的基因　限制酶　载体　受体细胞

B．重组DNA　RNA聚合酶　限制酶　连接酶

C．工具酶　目的基因　载体　受体细胞

D．模板DNA　mRNA　质粒　受体细胞

C　[基因工程是把供体生物的基因（目的基因）导入受体（细胞），并使其成功表达，以使受体获得新的遗传特性的过程。

因此该过程需要有目的基因、受体细胞及工具（工具酶和载体）。

]

基因工程的概念

背景材料　我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。

培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。

[思考交流]

1．填写下表，理解基因工程的概念。

手段

通过体外________和________等技术，赋予生物以新的________

目的

按照人们的愿望，创造出更符合人们需要的新的________和________

设计和施工水平　　　

____________水平

提示：

DNA重组　转基因　遗传特性　生物类型　生物产品　DNA分子

2．不同生物的DNA能够拼接成功的基础是什么？

提示：

都由四种脱氧核苷酸组成，都具有规则的双螺旋结构。

3．一种生物的基因能在另一种生物的细胞中成功表达的基础是什么？

提示：

所有生物共用一套遗传密码。

[归纳总结]

1．基因工程的原理是基因重组

自然状态下基因重组有两种情况：

减数第一次分裂前期四分体的非姐妹染色单体间的交叉互换和减数第一次分裂后期非同源染色体的自由组合。

基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。

2．基因工程的理论基础

（1）拼接的基础

①基本组成单位相同：

不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。

②空间结构相同：

不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。

③碱基配对方式相同：

不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。

（2）表达的基础：

生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。

3．基因工程可以按照人们的意愿，定向改造生物的遗传特性，从而产生定向的变异，并可实现不同物种间的基因交流，打破生殖隔离。

应与现代进化论中的“变异是不定向的”“物种间存在生殖隔离”区分开来。

1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。

实施该工程的最终目的是（　　）

A．定向提取生物体的DNA分子

B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”

C．在生物体外对DNA分子进行改造

D．定向地改造生物的遗传性状

D　[该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。

]

2．下列叙述符合基因工程概念的是（　　）

A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性

B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株

C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株

D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上

B　[基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物以新的遗传特性，A错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。

]

基因工程的工具酶

背景材料　

[思考交流]

1．DNA分子中磷酸与脱氧核糖是如何连接的？

该化学键的名称是什么？

提示：

DNA分子中磷酸与脱氧核糖交替连接。

其中同一核苷酸内部磷酸与脱氧核糖的5号碳相连，相邻两核苷酸之间磷酸与3号碳相连。

连接形成的化学键叫磷酸二酯键。

2．限制酶的作用特点是什么？

所识别的序列有何特点？

作用后的结果有哪两种形式？

提示：

（1）一种限制酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特点的位点上切割DNA分子。

（2）限制酶所识别的序列一般都具有反向对称重复排列的特点。

（3）黏性末端和平末端。

3．DNA连接酶的作用是什么？

提示：

将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来“缝合”成新的DNA分子。

[归纳总结]

1．限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源

主要从原核生物中分离纯化而来。

（2）特点

①具有专一性，表现在以下两个方面：

a．能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列；

b．切割特定序列中的特定位点。

②大多数限制性核酸内切酶的识别序列由6个核苷酸组成，但也有少数限制性核酸内切酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。

（3）识别序列的特点

呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。

如

以中心线为轴，两侧碱基互补对称；

为轴，两侧碱基互补对称。

中轴线

（4）作用结果：

限制酶切割DNA产生的DNA末端有黏性末端和平末端两种形式。

①黏性末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：

②平末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：

特别提醒：

（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。

（2）限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。

（3）不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。

（4）在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。

只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。

（5）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。

前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。

（6）判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：

将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。

2．DNA连接酶

（1）作用：

将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。

（如图）

DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（2）DNA连接酶的种类和特点

种类

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

特点

只能连接双链DNA片段互补的黏性末端

既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率较低

（3）DNA连接酶与DNA聚合酶的比较

项目

DNA连接酶

DNA聚合酶

作用实质

都是催化形成磷酸二酯键

是否需要模板

不需要

需要

连接DNA链

双链

单链

作用过程

在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键

将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键

作用结果

将两个DNA片段连接成重组DNA分子

合成新的DNA分子

特别提醒：

DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。

两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能通过DNA连接酶拼接起来；平末端只能用T4DNA连接酶连接。

（4）DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较

①区别

作用

应用

限制性核酸内切酶

使特定部位的磷酸二酯键断裂

用于提取目的基因和切割载体

DNA连接酶

在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键

用于目的基因和载体的连接

②联系

1．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是（　　）

注：

Y＝C或T，R＝A或G。

A．限制酶切割后不一定形成黏性末端

B．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部

C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端

D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列

A　[由表中信息可知，HindⅡ能识别4种不同的核苷酸序列；Sau3AⅠ酶的切割位点在识别序列的外部；BamHⅠ酶与Sau3AⅠ酶切割后能形成相同的黏性末端；SmaⅠ酶切割后产生的是平末端。

]

2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（　　）

A．T4DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来

B．E·coliDNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接

C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸

C　[DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。

E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。

T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。

]

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

背景材料　下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图：

[思考交流]

1．a代表的物质和质粒的化学本质都是________，都能进行自我复制。

提示：

DNA

2．若某目的基因切割末端为

，则与之相连的质粒上至少有一段核苷酸序列为________。

该质粒DNA分子的切割末端为________，可使用DNA连接酶把质粒和目的基因连接在一起。

提示：

3．氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。

氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是____________________。

提示：

标记基因　供重组DNA的鉴定和选择

[归纳总结]

1．载体的作用

（1）作为运载工具，将目的基因运送到受体细胞中去。

（2）在宿主（寄主）细胞内对目的基因进行大量复制和稳定保存。

2．作为载体必须具备的条件

（1）载体DNA必须有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因插入。

（2）能够在受体细胞中保留下来，且载体DNA必须具备自我复制能力，或能够整合到受体细胞染色体DNA上，并随染色体DNA进行同步复制。

（3）载体必须带有特殊的标记基因，以便重组后进行重组DNA的鉴定和筛选。

常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。

（4）对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。

3．常用种类

种类

用途

质粒

将外源基因载入大肠杆菌等受体细胞

λ噬菌体的衍生物

植物病毒

将外源基因载入植物细胞

动物病毒

将外源基因载入动物细胞

特别提醒：

（1）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。

（2）一般来说，天然载体不能同时满足上述条件，要对其进行人工改造才可以使用。

1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。

下列有关叙述正确的是（　　）

A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子

B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点

C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制

D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择

[答案]　D

2．下列有关基因工程的工具的叙述，正确的是（　　）

A．基因工程的载体都是质粒

B．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列

C．λ噬菌体的衍生物可以作为动物基因工程的载体

D．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞

B　[基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等；λ噬菌体的衍生物不可作为动物基因工程的载体；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造。

]

[课堂小结]

知识网络构建

核心语句归纳

1.基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。

2．不同生物基因能拼接在一起的理论基础是，DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。

3．外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。

4．DNA重组技术的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使基因进入受体细胞的载体。

5．限制性核酸内切酶可识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。

6．DNA连接酶根据来源不同可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。

E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。

7．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

1．下列关于质粒的叙述，正确的是（　　）

A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器

B．质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型双链环状DNA分子

C．质粒只有在侵入受体细胞后才能复制

D．细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的

B　[质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型双链环状DNA分子。

质粒在受体细胞和自身细胞内均能自我复制。

]

2．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（　　）

A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键

B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键

C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键

D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接

B　[DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。

但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。

]

3．现有一长度为1000个碱基对（bp）的DNA分子，用限制酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用KpnⅠ单独酶切后得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子。

如图所示，该DNA分子的酶切图谱正确的是（　　）

D　[该DNA分子用限制酶EcoRⅠ切割后长度不变，可知该DNA分子为环状结构，根据EcoRⅠ、KpnⅠ的作用特点，可知酶切图谱为D项所示。

]

4．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于____________________________。

（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。

若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

______________________。

（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复________键，成功地获得了重组质粒，这说明_____________________________________________

_____________________________________________________。

（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。

再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。

与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________。

[解析]　

（1）构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。

（2）EcoRⅠ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。

根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。

（3）DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干可知，两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。

（4）与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是能抗氨苄青霉素和四环素的人工质粒即pBR322质粒。

[答案]　

（1）重组DNA的鉴定和筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）

（2）

（3）磷酸二酯　两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素　pBR322质粒