心肌肌钙蛋白的融合表达和分离纯化解读.docx

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心肌肌钙蛋白的融合表达和分离纯化解读

心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

劳兴珍1,吴国球2,何贝斌

绵3,沈子龙3

（1.中国药科大学生物信息学教研室,江苏南京210009;2.东南大学附属中大医院检验科,

江苏南京210009;3.中国药科大学生物技术中心,江苏南京210009

　　摘　要:

目的研究人心肌肌钙蛋白（cTnⅠ

在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。

方法人cTnⅠDNA序列由pdf52cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a（+载体,构建成

pET32a（+2cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21（DE3为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。

硫氧还蛋白（TrxA2cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质白质具有cTnⅠ免疫原活性。

结论构建了pET32a（+2cTnⅠ重组质粒,,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。

　　关键词:

心肌肌钙蛋白Ⅰ;融合表达;;　　中图分类号:

R542.22;R786　　　　21678（20060320150203

coliandaffinitypurificationoftroponinⅠ

ing2zhen1,WUGuo2qiu2,HEYun2mian3,SHENZi2long3

（1.ofBioinformaticsofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China;

2.DepartmentofLaboratory,theAffiliatedZhongdaHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China;

3.TheBiotechnologyCenterofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China

　　Abstract:

PurposeThepresentworkwastoexpressastableheterologoushumancTnⅠfusionproteinto

TrxAaspartofanoverallstrategyfortheisolationandpurificationofenoughmaterialforuseasadiagnosticcalibrator.MethodsTheDNAsequencewasisolatedfromthecDNAplasmidpdf52cTnⅠbyPCRandclonedasafusiontotheC2termiusofTrxAandtherecombinantcTnⅠexpressionvectorwasconstructedandex2pressedinhostE.coliBL21（DE3.ResultsWheninducedwithIPTG,thepET32a（+2cTnⅠwashighlyexpressedinE.coli.Thefusionproteinwasaffinity2purifiedoveraHistrapColumn.ThetroponinⅠfusionproteinwasassayedandfoundtoexhibitsimilarimmunogenicresponserelativetonaturalcardiactroponinⅠ.ConclusionTheresultsdemonstratedthatTrxA2cTnⅠwassuccessfullyexpressed.TherecombinantcTnⅠwasapplicableinearlydetectionofacutemyocardialinfarction.

Keywords:

cardiactroponinⅠ;fusionexpression;IrxA;acutemyocardialinfarction;affinitypurifica2tion

收稿日期:

2005210218;修回日期:

2005212214

作者简介:

劳兴珍（19782,女,广西灵山人,硕士,助教,主要研究方向为微生物与生化药学;沈子龙（19402,男,通讯作者,教授,博士生导师,主要研究方向为微生物与生化药学:

025*********。

　　1995年美国FDA批准心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ作为急性心肌梗死（AMI的最新实验诊断指标。

与

其它指标相比,cTnⅠ在血中出现持续的时间长,且为心肌细胞所特有。

在心肌细胞膜完整的情况下,cTnⅠ不能透出细胞膜进入血循环。

当心肌细胞因缺血、缺氧发生变性坏死时,cTnⅠ可通过破损的细

胞膜释放入血。

由于cTnⅠ相对分子质量（Mr较小并持续从变性细胞中溢出。

因此对AMI诊断敏感性高,特异性强,还可用于AMI的后期监护、预后及疗效判断[1]。

用传统的分离方法从人心肌组织中提取cTnⅠ是非常困难的。

为此,我们以pET32a（+为cTnⅠ克隆基因的表达载体,在大肠杆菌中经诱导后高效表达出TrxA2cTnⅠ融合蛋白,为制备高质量质控产品及建立相关的检测方法打下基础。

1　材　料

pdf52cTnI质粒,中国药科大学生物技术中心

51中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第3期

构建;pET32a（+,美国Novagen公司;JM109、BL21（DE3,中国药科大学生物技术中心保存;dNTP、10PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶,上海生工生物技术有限公司;T4DNA连接酶,美国Promega公司;cTnⅠTestKit,美国CorteaDiagnostic公司;HisTrapkit,Amersham公司;Ampgene4800PCR仪,北京昊诺斯科技有限公司;其它试剂均为国产或进口分析纯。

2　方　法

2.1　pET32a（+2cTnⅠ质粒的构建[2]

人cTnⅠDNA序列由pdf52cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得。

PCR的条件为:

pdf52cTnⅠ模板1μL,10buffer5μL,10mol/LdNTP1μL,TaqPlus0.5μL,引物各1μL,最后加1滴石蜡油,置于PCR仪,955min变性后,执行94℃1min,56℃,℃1min程序,25个循环后72℃

1.2%

设计有EcoR,先用EcoRⅠ和HindⅢ酶切PCRpET32a（+质粒,分别回收片段和载体,将此片段和载体按适当的比例进行连接,并转化至JM109宿主菌中,经挑选得到阳性重组质粒,命名为pET32a（+2cTnⅠ。

2.2　pET32a（+2cTnⅠ的表达

将重组质粒转化至BL21（DE3菌种,37℃培养过夜,以1%的接种量转接,培养至A600nm值为0.6~0.8时,加入终浓度为1mmol/LIPTG进行诱导表达。

培养4h后,离心收集菌体,使用12%SDS2PAGE检测目的蛋白质。

2.3　TrxA2cTnⅠ融合蛋白的亲和纯化

2.3.1　蛋白质初提物的提取　将菌体悬浮于20mmol/LTris2HCl（pH8.0、0.5mmol/LEDTA缓冲液中。

冰水浴上超声裂菌。

待菌液黏度下降后,

10000r/min离心10min收集菌液上清。

2.3.2　HisTrapkit亲和色谱　将细胞裂解液上清上样于已用平衡缓冲液Ⅰ（pH8.0,20mmol/LTris2HCl,10mmol/L咪唑预平衡过的亲和柱。

上样完毕后,先用平衡缓冲液Ⅰ充分洗柱,后分别用含20,40,60,100,300,500mmol/L咪唑的20mmol/LTris2HCl（pH8.0进行分步洗脱。

取少量供试品进行电泳分析。

2.4　以肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测目的蛋白质免疫活性

将菌体裂解液上清直接上样于测试板的小孔内,同时含pET32a（+的BL21（DE3同样进行细胞破碎,并将菌体裂解液上清作为阴性对照。

3　结　果

3.1　pET32a（+2cTnⅠ表达载体的构建

将cTnⅠ基因克隆入pET32a（+的EcoRⅠ和HindⅢ位点,通过铺板、培养、扩增、酶切等操作初选出阳性克隆,酶切图谱见图1,重组质粒由上海生物工程有限公司进行测序,结果与预期序列一致

。

（EcoRⅠ+HindⅢ;2.pET32a（+2cTnⅠ重组质粒以EcoRⅠ+HindⅢ进行双酶切;3,4.pET32a（+2cTnⅠ重组质粒分别以EcoRⅠ,HindⅢ进行单酶切

1.λDNAmarkers（EcoRⅠ+HindⅢ;2.pET32a（+2cTnⅠrecombinantplasmiddigestbyEcoRⅠandHindⅢ;3,4.pET32a（+2cTnⅠrecombi2nantplasmiddigestbyEcoRⅠ,HindⅢ,respectively

图1　pET32a（+2cTnⅠ重组质粒的酶切分析

Fig1　RestrictionenzymedigestionanalysisofpET32a（+2cTnⅠrecombinantplasmid

3.2　目的蛋白质的诱导表达和纯化

挑取重组菌单菌落在LB中37℃培养过夜,以1%的接种量转接,培养至A600nm值为0.6~0.8时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,继续培养4h后,离心收集菌体,使用12%SDS2PAGE检测目的蛋白质。

电泳结果显示:

与对照组相比,发现有新的蛋白质条带产生（图2。

观察发现,加入IPTG诱导后,转入空载体的细菌总蛋白质提取物中出现1个Mr为20000的新蛋白质,而转入重组质粒pET32a（+2cTnⅠ的细菌总蛋白质提取物中出现的新蛋白质Mr为44000左右。

分析认为,空载体上产生的蛋白质是TrxA,而重组质粒pET32a（+2cTnⅠ质粒中产生的蛋白质是TrxA2cTnⅠ融合蛋白。

进一步的分析证明目的蛋白质大部分以裂解液上清形式存在。

结果表明载体构建成功,而且适用于蛋白质的高效可溶性表达。

细胞裂解液上清经亲和柱分步洗脱后,纯化的TrxA2cTnⅠ融合蛋白主要位于300mmol/L咪唑洗脱峰中,达到电泳纯（图3。

3.3　TrxA2cTnⅠ的免疫活性

阳性菌落经IPTG诱导后,离心得到菌体并破碎获得上清后,由肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测到151

中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第3期

cTnⅠ蛋白免疫原活性（图4。

证明了目的蛋白质

得到正确表达

。

1.诱导前全菌;2.含pET32a（+质粒的诱导后全菌;3.含pET32a（+2cTnⅠ重组质粒的诱导后全菌;4.中Mr标准蛋白质1.UninductedlysateofBL21;2.InductedlysateofBL21[DET32a（+];3.InductedlysateofBL21[pET32a（+2cTnⅠ];4.Proteinmarker图2　Fig2　SDS2PAGEanalysisofproteinbefore

induction1.中Mr标准蛋白质;2.纯化的TrxA2cTnⅠ融合蛋白1.Mediumproteinmarker;2.PurifiedTxA2cTnⅠfusionprotein

图3　纯化蛋白质的电泳分析

Fig3　SDS2PAGEanalysisofpurifiedfusionprotein

4　讨　论

本文采用的原核表达载体pET32a（+,含T7

启动子和转录终止信号,其特点除了能够编码6个组氨酸残基外,还带有大肠杆菌硫氧还蛋白（TrxA基因。

TrxA基因编码109个氨基酸的硫氧还蛋白。

硫氧还蛋白是低Mr的氧化还原酶,在蛋白质折叠过程中可催化二硫键的正确形成,对大肠杆菌表达的重组蛋白质正确折叠更为有效,从而增加蛋白质的可溶性[324]。

外源基因经多克隆位点插入后与TrxA一起融合表达,外源蛋白质与硫氧还蛋白融合表达不仅提高了表达产物的稳定性

而且由于Mr

1.以含pET32a（+质粒诱导后菌体的破碎后上清为阴性对照;2.

含重组质粒诱导后全菌体的破碎后上清

1.InductedlysateofBL21[pET32a（asnativecontrol;2.Inducted

lysateof32a（+2cTn]

4　assayoffusionprotein

S2分析时更容易鉴定。

此外,外源

别位点,从而使外源蛋白质与硫氧还蛋白的分离变得方便。

游离的cTnⅠ在血液中很不稳定[526],易降解,Mr较小,因此把cTnⅠ基因融合在TrxA基因的下游,表达成较大Mr的融合蛋白质,增加其稳定性。

这一目的蛋白质在大肠杆菌中得到高效表达以及快速纯化,为以后制作ELISA快速诊断试剂盒奠定了基础。

参考文献:

[1]　WuAH,FengYJ,JohnHC,etal.Comparisonofmyoglobin,creatine

kinase2MB,andcardiactroponinⅠfordiagnosisofacutemyocardialinfarction[J].AnnClinLabSci,1996,26（4:

2912300.

[2]　MarkH,LindaT,JulieW,etal.ExpressioninEscherichiacoliand

affinitypurificationofaCKS2TroponinⅠfusionprotein[J].ProteinExpressPurif,1995,6（3:

2562264.

[3]　LaVallieER,DiblasioEA,KovacicS,etal.Athioredoxingenefu2

sionexpressionsystemthatcircumventsinclusionbodyformationinthe

E.colicytoplasm[J].Biotechnology,1993,11（2:

1872193.

[4]　LaVallieER,LuZ,Diblasio2SmithEA,etal.Thioredoxinasafusion

partnerforproductionofsolublerecombinantproteinsinEscherichia

coli[J].MethodsEnzymol,2000,326:

3222340.

[5]　ShiQW,LingMF,ZhangXC,etal.Degradationofcardiactroponin

ⅠinserumcomplicatesofcardiactroponinⅠassays[J].ClinChem,

1999,45（7:

101821025.

[6]　LiuSW,ZhangMY,SongQL,etal.Recombinantsinglechaincar2

diactroponinI2Cpolypeptides:

superiorcalibrationandcontrolmateri2alsforcardiactroponinⅠimmunoassays[J].ClinLab,2001,47（122:

19227.

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