脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告模板一_精品文档.doc
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医学微生物学实验报告
姓名_____________
学号___________
年级_______
组别________
实验名称
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
实验者
合作者
日期
指导老师
一、实验目的
1、掌握培养基的制备的原则和一般方法
2、掌握细菌的分离培养方法
3、掌握油镜的正确使用，细菌标本图片的制备
4、掌握细菌的形革兰氏染色法以及形态学检查方法
5、熟悉细菌的生化试验方法（糖发酵试验、抗菌素敏感性试验、血浆凝固酶实验、动力学实验）的原理及方法
6、掌握玻片凝集试验的原理及方法
二、实验器材
1、5ml试管15支、托盘天平、锥形瓶、营养肉汤干粉培养基、量筒、使馆狂、酒精灯、洗耳球、刻度吸管
2、脓汁标本1支，粪便标本1支、伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个、接种环、酒精灯
3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）
4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张
5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。
6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤
流程图：
营养琼脂培养基的制备
细菌的分离培养
细菌的纯培养
细菌形态学检查
液体培养基接种
细菌的生化实验
1、营养肉汤培养基的制备
①称取1.1g营养肉汤干粉培养基于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水溶解
②加热煮沸1次，加热时需要摇动
③分装于15支小试管中，每支3ml
④集中放在试管筐中，罩上硫酸纸和牛皮纸，用橡皮筋包扎好
⑤灭菌
2、细菌的分离培养
平板画线法：
小组分工：
甲→脓汁标本→营养琼脂平板丙→粪便标本→伊红美蓝平板
乙→脓汁标本→营养琼脂平板丁→粪便标本→伊红美蓝平板
步骤：
①点燃酒精灯，把接种环在酒精灯上烧灼灭菌，金属杆快速通过火焰2～3次，以杀灭表面微生物。
②取出标本，在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之，管口迅速通过火焰3次
③将冷却的接种环沾取标本1环，管口迅速通过火焰灭菌后塞上棉塞放回。
④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。
画完第一区要烧掉接种环上多余的标本。
转动平板，转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划过第二到五区，接种环呈递减次数地通过第二到第四区。
⑤平板倒置，37℃培养18~24h,观察结果。
3、细菌的纯培养（斜面接种法）
分工：
甲→金黄,乙→白色。
丙→紫黑,丁→粉红。
步骤：
①取制作的平板，在菌落分布最稀疏的区域，选择平板上典型的、容易挑取的单菌落。
（从营养琼脂平板中分别选取金黄色菌落、白色菌落，从伊红美蓝平板上分别选出紫黑色菌落、粉红色菌落。
）
②接种环套住菌落，轻轻刮取细菌。
③接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。
再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。
④37℃培养24小时，观察结果。
4、细菌形态学检查（革兰氏染色法）
①加样枪取盐水左3ul、右3ul,水滴间距小于2cm。
②挑取菌苔少许（1mm小菌落的半量）与生理盐水混匀，涂成1cm2大小的均匀薄膜
③涂毕，环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，将接种环通过火焰灭菌
④涂片在室温干燥或烘干，手持玻片一端，标本面朝上，在火焰外层快速通过2~3次，将标本固定，促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。
⑤革兰染色：
初染：
结晶紫→初染1分钟→水洗
↓
媒染：
卢戈碘液→媒染1分钟→水洗
↓
脱色：
95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗
↓
复染：
稀释品红→复染1分钟→水洗
↓
吸干,镜检。
5、液体培养基接种
分组：
甲→金黄乙→白色,
丙→紫黑丁→粉红。
①无菌操作，接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。
②在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环，烧灼灭菌。
6、细菌的生化实验
（一）半固体穿刺接种法
分工：
甲→紫黑,乙→紫黑；丙→粉红,丁→粉红。
①无菌操作，接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。
②管口、接种针经火焰烧灼灭菌。
（二）细菌的糖发酵试验
分工：
甲→紫黑→①葡萄糖丙→粉红→③葡萄糖
乙→紫黑→②乳糖丁→粉红→④乳糖
①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处，切割一道切痕。
将管子打开，管口烧灼灭菌
②接种针针尖斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
③管口朝向相同，放置在平皿内。
（三）抗菌素敏感性试验（纸片扩散法）
①接种环取菌液3～5ul2次,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”（操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）。
②平板密集划线接种细菌（纱窗样）。
每次将平板旋转90°，保证菌液均匀分布。
③设计三点，作标记：
青、链、庆。
呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。
④镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。
⑤做标记，37℃18～24小时培养，观察结果。
（四）血浆凝固酶试验
兔血清+白色和黄色
①取2滴兔血浆置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔（约2～3个菌落的菌量）与血浆研磨混合，立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。
7、细菌的血清学试验（玻片凝集试验）
①取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul
②用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀，涂抹展开。
③载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。
④菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性
四、结果与讨论
1、营养肉汤培养基的制备
图1：
营养肉汤培养基的制备
图2.2丙，丁→粪便标本→伊红美蓝平板
图2.1甲，乙→脓汁标本→营养琼脂平板
2细菌的分离培养
平板画线法：
结果观察：
1、由实验结果图可看出，脓汁标本在普通平板上有金黄色、白色两种菌落，菌落直径约2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明。
2、粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、粉红色两种菌落，颜色不是细菌本身的颜色，其中紫黑色菌落较大较明显，且形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。
讨论：
1、粪便标本在伊红美蓝平板上，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。
2、从四张平板画线的结果上来看，第三张图分离效果很好，得到的菌落典型。
而其他三张均有不足。
第一二张脓汁的营养琼脂平板，前面两区涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明显的菌落。
第四张粪便的平板第一区太稀疏，未充分利用平板，故在培养后未见到数量较少的粉红菌落，原因是划线时不熟练，不能连续划线。
3、细菌的纯培养（斜面接种法）
图3.1斜面接种产物（右左向右依次为金黄，白色粉红，紫黑菌苔）
结果观察与讨论：
1、从普通平板上挑取的金黄色和白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，仍然呈金黄色和白色。
2、从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、半透明。
4、细菌形态学检查（革兰氏染色法）
图4.1脓汁菌苔（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔）
图4.2粪便菌苔（左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔）
结果观察与讨论：
1、从脓汁标本中分离得到金黄色、白色两种菌落，显微镜油镜下呈紫色为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
2、从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
显微镜油镜下呈粉红色为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、液体培养基接种
图5液体培养基接种结果
6、细菌的生化实验
（一）半固体穿刺接种法
图6.1（照片拍摄不明显）
结果观察及讨论：
表1.动力试验结果
菌苔半固体
紫黑细菌1+
紫黑细菌2-
粉红细菌1-
粉红细菌2-
+：
阳性-：
阴性
1、紫黑细菌1细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态，有鞭毛。
但是实验时发现紫黑菌苔2无任何现象。
经过分析，应当是用接种针取菌苔时，操作者仅针尖前部接触了少量菌苔，导致穿刺后无细菌的生长。
但是结合其他组的结果，我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。
2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长，可看出其无鞭毛。
（二）细菌的糖发酵试验
图6.2.从左至右分别为：
（④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖）
结果观察与讨论:
1、实验结果记录为下表：
①葡萄糖②乳糖③葡萄糖④乳糖
⊕⊕+-
+：
产酸或阳性⊕：
产酸产气-：
阴性
2、紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。
（三）抗菌素敏感性试验（纸片扩散法）
图6.3
结果观察与讨论：
1、表3各菌抑菌圈直径（mm）表
菌苔青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色422530
白色302240
紫黑
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