06第七章凝胶过滤pptConvertor.docx

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第六章

凝胶过滤

凝胶过滤（又叫分筛层析）是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。

其原理是：

凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物却被排阻在外部;

当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。

凝胶过滤特点：

设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等。

常用于：

分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物；

还可用于:

测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。

第一节凝胶的分类及性质

凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。

这化合物目前主要有：

葡聚糖凝胶

天然琼脂糖

交联琼脂糖

其次还有：

聚丙烯酰胺凝胶（生物胶Bio-gel）

交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶

交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶（superdex）

详见表6-1。

一、葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex。

它是由葡聚糖[右旋糖酐（G型）]和3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂）以醚键相互交联而成的。

其结构式如图6-1所示。

在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。

1．理化性质

葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。

它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。

由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异：

膨胀度（床体积）

吸水量（每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量）

筛孔的大小

分级范围

葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样，详见表6-2。

以G型葡聚糖凝胶（经水溶液膨胀）作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。

以LH型葡聚糖凝胶（经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀）作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。

2．稳定性

葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。

在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温（120℃）消毒0.5h，其性质并不改变。

在0.1mol／LHCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／LHCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。

当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。

葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。

3．吸附性

葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含10~20μg当量的羧基基团所致。

羧基基团能与分离物中电荷基团（尤其是碱性蛋白质）发生吸附作用。

这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。

当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。

因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。

新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响（虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析）。

此外；葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，

若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理。

二、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离出来的。

在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。

琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。

这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时呈固态。

它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。

该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。

琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。

琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。

琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose2B（2％）、4B（4％）和6B（6％）。

Sepharose6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。

Sepharose与1，3-二溴异丙醇（1，3-dibromopropano1）在强碱性条件下反应后，即生成CL-型交联琼脂糖。

这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性都有了提高。

CL-型交联琼脂糖可在广范围的pH溶液（pH3~14）中使用，即使用较强的碱溶液短时间处理，其性能也不会改变，

但是，在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。

琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。

正如前章所述，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。

琼脂糖凝胶的有关性质见表6-1和表6-3。

三、聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。

它是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作交联剂，以过硫酸铵作催化剂，

在N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED）加速剂的作用下，

将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。

当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。

商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10-3。

一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。

该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；

在pH1~10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触。

聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。

聚丙烯酰胺凝胶的物理性质见表6-4。

四、Sephacryl

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的。

属硬性凝胶，具有筛孔和少量的羧基基团。

Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um（见表6-5）。

通常是用于水相系统中。

若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。

它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；

它可在pH2~11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；

在0.2mol／LNaOH溶液中（室温）处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响。

用去污剂（如SDS）、6mol／L盐酸胍和8mol／L尿素溶液可作为洗脱剂，

高温（120℃）消毒（pH7.0时）处理后，层析性质没有明显变化。

Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖（proteoglycans），甚至大的病毒颗粒（直径>300-400nm）也可用它分离。

层析时，用细颗粒凝胶分辨率高

五、Superdex

Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。

该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。

在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范围内变化，溶液中加入去污剂（如1％SDS）和（或）解离剂（如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍）时，也不会影响分离效果。

此凝胶共有6种类型，详见表6-6

除上述5类凝胶外，还有：

Superose（高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级）、

玻璃珠

聚苯乙烯凝胶

等也具有分子筛功能。

玻璃珠

有大量的网孔，且分布均一;

它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响;

缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。

第二节基本原理

凝胶过滤层析的基质:

具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

排阻、扩散效应（见下图）

这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，

而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0~100％之间。

分配系数Kav

用分配系数Kav表示被排阻的程度；即：

分离化合物分配在内水和外水体积中的比例关系。

Kav值的大小依赖于凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）。

即:

Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

在限定的层析条件下，

Vt和Vo都为恒定值，

Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。

分离物分子质量大，Kav值小；

反之，Kav值增大。

分离过程

在同一凝胶过滤柱上分子质量不同的混合物质，由于流动相的作用，这些物质将发生排阻和扩散效应。

若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生；

结果是分子质量大的物质先从柱中流出，

分子质量小的物质则后从柱中流出。

（见图6-2）

流出物分管等量或等时地收集，

检测后分段合并相同组分的各管流出物，把分子质量不同的物质相互筛分开了。

筛分效果

受操作条件的影响（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）；

更为直接的影响是Kav值的差异性。

Kav值差异性大，分离效果好；

Kav值差异性小，乃至等于1或等于零（即使样品中各组分的分子质量相差很大），则分离效果很差，或根本不能分开。

Kav值的计算

从公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出，

只要测出：

床体积Vt

外水体积Vo

洗脱体积Ve

即可计算出Kav值。

凝胶床总体积Vt的求得

有如下2种方法可求得Vt

I.计算法

根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示

Vt=πr2h

式中,r为层析柱半径；

h为凝胶床高度；

π为圆周率。

II.测量法

已知，床体积Vt

Vt=Vo+Vi+Vg

因Vg与Vt相比是很小的，可忽略不计，故

Vt=Vo+Vi

Vo和Vi可以通过实验测得（见图6-3），如下：

通过实验求Vo和Vi

当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，

溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。

凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积Vo，

即:

Ve=Vo（Kav=0）

溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内；

凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积,

即:

Ve=Vt=Vo+Vi（Kav=1）

则:

Vi=Ve-Vo

溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积

Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0～1之间）。

实践中

测定外水体积（Vo）

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

理由是：

该物质分子质量大（为200万），呈蓝色，

在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，

并可借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（在210nm或260nm、620nm）洗脱体积Ve，即

Ve=Vo

测定内水体积（Vi）

可选用硫酸铵、N—乙酰酪氨酸乙酯，或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。

即：

Vi=Ve-Vo

洗脱体积Ve

分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者的洗脱体积Ve也是通过实验测得。

故可求得某一分离物的Kav值=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。

分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用Ve／Vo或Vo／Ve（R值）表示。

这些值的大小见图6-3。

第三节操作

一、凝胶的选择和处理

1．凝胶的选择

（1）型号

凝胶型号多。

型号不同，筛分范围亦不相同。

SephadexG型一般适宜于分离蛋白质。

蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。

一般来说，

在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。

（2）粒度

凝胶的粒度有粗有细（与交联度无关）。

细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果较粗得好（见图6-4）。

但细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类凝胶用于小型试验，可得到满意结果。

粗颗粒凝胶流速快，宜用于小直径的层析柱，如操作得当也可得到较满意的结果。

2．凝胶用量的计算

根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度（见表6-2），按下面的公式可计算出所需干凝胶的用量：

干凝胶用量（g）=πr2h/膨胀度

膨胀度=床体积/g

用此法计算出的干凝胶用量还需增加10％~20％，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。

3．凝胶的处理

将所用的干凝胶慢慢倾人5~10倍的蒸馏水中，（参照表6-2凝胶溶胀所需的时间）进行充分浸泡

然后用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒

再用0.5mol／LNaOH-0.5mol／LNaCl溶液在室温下浸泡0.5h

以抽滤法除去碱液

用蒸馏水洗至中性。

注

为了除去凝胶颗粒空隙中的气泡：

可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水或平衡液中用抽气方法实现。

有时采用加热煮沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀速度。

但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热

二、凝胶柱的制备

1．柱的选择

当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高（见图6-5Ⅱ、Ⅲ）；

当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；

当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高。

一般理想的层析柱之直径与长度之比是

1：

25~1：

100

2．装柱

装柱的具体操作与要求按第三章吸附柱层析的装柱方法进行。

3．凝胶柱的鉴定

新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg／ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。

如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没有裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。

如果凝胶柱鉴定时用的是蛋白质类物质进行，除能起到鉴定柱子的作用外，还可起到克服某些分离物被不可逆吸附的作用。

三、加样与洗脱

1．加样

加样量与测定方法和层析柱大小有关。

如测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。

例如：

一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法：

当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右（柱体积2cm×60cm）；

当采用220nm观察消光读数时，加样量只需1.2mg左右。

一般来说，

加样量越少，

或加样体积越小（样品浓度高时），

分辨率越高。

加样体积多少为宜?

要视被分离物在层析柱的分配系数（Kav）或洗脱体积（Ve）来决定。

假设：

A、B两个被分离物在层析柱中分离，

洗脱体积分别为VeA、VeB，

分配系数分别为Kav’、Kav”。

A、B两物洗脱体积之差称为分离体积，以Vs表示。

则Vs=VeA-VeB。

当，样品体积（Vp）=Vs时，

理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开。

实际情况并非如此，

由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大。

因此，

当Vp≥Vs时，

A、B两种物质就不能完全分开（见图6-6Ⅱ）；

当Vp＜Vs时，

A、B两种物质就能分开（见图6-6I）。

求Vs

根据Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

则Ve=Vo+Kav（Vt-Vo）

则Vs=VeA-VeB

=（Kav’-Kav”）（Vt-Vo）

即，分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床体积有关。

所以，为了提高分离效果，在一定范围内，加样体积越小越好。

此外，样品的黏度也影响层析的分辨率。

一般使用的样品黏度以小于2，或者与洗脱液的黏度相当为宜。

2．洗脱

洗脱液选择

能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。

一般地，都以单一缓冲液（如磷酸缓冲液、Tris·HCl缓冲液等）,或者盐溶液作为洗脱液，有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。

流速

洗脱时的流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。

控制流速的最好装置是恒流泵（微量泵），它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。

若无此装置，可用控制操作压的办法进行。

3.收集

分管收集洗脱液。

4.测定

选用适当的方法进行定性和定量测定。

四、凝胶柱的再生及保存

1．再生

仅使用过一次的凝胶柱，通常进行重新平衡后即可再次使用；

使用过多次后，由于凝胶床体积变小、流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。

须进行再生处理。

方法是，先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行平衡。

平衡毕，即可重复使用；

另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用

2．保存

若要短时间保存，则需进行反复洗涤除去蛋白质等杂质，并加入适当的防霉剂（见表6-8）；

若要长时间保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。

其方法如下：

洗涤将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，

再用水反复洗涤除去杂质、过滤抽干。

脱水浸泡在50％乙醇溶液中进行脱水。

然后，再过滤抽干；

并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中。

如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，

待乙醇浓度增加至95％时，将凝胶抽干；

干燥置60、烘箱中烘干，可装瓶保存。

第四节应用

一、脱盐和浓缩

利用盐类小分子物质可以进入凝胶筛孔中，而大分子物质则被排阻在其外的原理，可进行蛋白质等溶液的脱盐。

该法脱盐的速度不仅比透析快，而且不会引起大分子物质变性。

此外，利用凝胶的吸水性能，对生命大分子溶液进行浓缩也是很有效的。

一般用于这些操作的材料是细颗粒葡聚糖凝胶G-25。

二、分离生命物质

对于某些理化性质相似（如溶解度、带电性质）而分子质量不同，或者是聚合体不等的混合溶液，采用凝胶过滤法就很容易分离。

三、去热源物质

去热源物质常常是各种注射剂中的一个难题。

虽然已有一些方法（如活性炭吸附、离子交换吸附等）解决，但均不如凝胶过滤方便。

所谓热源物质可能是糖蛋白一类大分子物质。

一般在制备水解蛋白、核苷酸和酶注射液时，采用凝胶过滤法去除热源物质效果较好。

四、测定分子质量

原理：

Kav值与蛋白质分子质量（M）之间存在线性关系，即：

Kav=-blgM+c。

先，用分子质量的标准物质进行过滤层析后求标准曲线。

将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析。

物质分子质量不同，故洗脱体积也不同。

根据洗脱体积求出Kav值，依Kav=-blgM+c，绘出一条标准曲线。

后，在同样条件下，进行未知分子质量物质的过滤层析后求出其Kav值。

以此值在标准曲线上就能求出其分子质量。

用该方法测定分子质量，操作简便，容易掌握，需要样品量较少，故实用价值颇大

1．用凝胶柱层析制作测定蛋白质分子质量标准曲线的方法

操作要点

装柱

取葡聚糖凝胶G-100，处理后按要求装柱（2cm×60cm），令夹层温度为34～35℃。

上样

蛋白质样品：

巨球蛋白3.7mgN-乙酰酪氨酸乙酯0.3mg

核糖核酸酶3.7mg细胞色素C3.0mg

胰蛋白酶3mg卵清白蛋白3rug

血清白蛋白单体3mg

洗脱

用离子强度为0.02～0.05的中性磷酸缓冲液洗脱。

流速0.62ml／min左右，记录280nm消光值。

求细胞色素C的Kav值：

Vo=67.8ml

Vt-Vo=150.8ml

Ve-Vo=105.2ml

Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）=105.2/150.8=0.70

求出其他蛋白质的Kav值

用同样的方法可求出其他蛋白质的Kav值（见表6-9）。

绘制的曲线

以Kav值为横坐标，以lgM为纵坐标，绘制的曲线如图6-14。

为何Vo不恒定？

61.4~67.8

实验误差。

另一方法：

根据不同蛋白质的分子质量与其相应洗脱体积的关系，分别以它们的值作横坐标和纵坐标，照样可绘出标准曲线（见图6-15）。

此法不仅适合测定大分子质量的物质，而且也适合测定一万以下的小分子质量的物质（见图6-16）。

用凝胶过滤层析法测定分子质量有如下局限性：

①洗脱液在pH6～8的范围内，Kav=-blgM+c的线性关系比较好。

而在极端pH值时，要防止因变性引起偏离。

②一般球状蛋白质的轴比虽有差异，但IgM与Kav值的线性关系依然维持。

而纤维状蛋白质轴比大，不能运用上述公式。

如血纤维蛋白就属这种情况。

③糖蛋白中糖占的比例大于5％时，测得的分子质量偏大。

这可能是糖在溶液中有较大的水合值所致。

而铁蛋白与糖蛋白情况相反，故测出的分子质量比实际值小。

推测这一现象的发生是由于铁的存在使蛋白质外壳的结构更加紧凑之故。

④变性剂（如尿素）和盐酸胍存在时，只要在同样的条件下测出标准曲线，依然遵守上述公式的关系。

⑤有些酶类如淀粉酶能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应。

2．用葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子质量

葡聚糖凝胶薄板层析和普通凝胶层析相类似，被分离物质的分子质量和层析特征之间同样有十分密切的关系，即：

不同蛋白质的相对迁移距离和它们的分子质量对数值之间呈线性关系。