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生物工程概论课程论文

序号（学号）：

11015010123

生物工程概论课程论文

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

姓名涂超

学院化学化工学院

化学工程与工艺

专业________________________

班级110150101

20121205

________年_____月_____日

摘要随着植物转基因研究的不断深入，核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果。

植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作，外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决“顺式失活”和“位置效应”等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题，成为植物基因工程发展的新方向，在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用，也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路。

本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上，重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原。

最后，对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析。

未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善，叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军。

关键词叶绿体转化,基因工程,疫苗生产

ChloroplastTransformationandtheLatestProgressofitsApplicationinVaccineExpression

AbstractWiththedeepeningresearchintoplanttransgenosis,theapplicationeffectofgeneticengineeringhasbeenseriouslyinfluencedbythetransgenicsilencing.Byusingchloroplastgenomeasaplatform,chloroplastgenetictransformationmanipulatesgenesinplant.Theadvantagesofexogenousgenesiteintegrationandmaternalinheritancecaneffectivelyovercomethesecurityissuesof“genesilencing”and“transgeneescape”,suchas“cis-inactivation”and“positioneffect”.Therefore,chloroplastgenetictransformationcouldleadanewperspectivetotheplantgeneticengineering.Itplaysanimportantroleintheindustrial,agriculturalandbiomedicalfields,andalsoprovidesnewstrategiestomanufacturecheapandsafeplantvaccine.Inthispaper,webrieflyintroducetheprinciplesofchloroplasttransformation,itsmethodsandsuperiority.Inaddition,wereviewandhighlightrecentstudiesofchloroplastengineeringrelatedtosomeimportantvaccineantigensexpression,includingviralantigensandbacterialantigens.Finally,someproblemsaboutchloroplasttransformationtechnologyinexpressingforeigngeneswerediscussed.Inthefuture,withcontinuousreinforcementoftheresearchaboutchloroplastgeneexpression,andregulationmechanism,aswellastheimprovementoftherelatedtechnicalsystem,thechloroplasttransformationisexpectedtobecomethevitalforceofthevaccineproduction.

KeywordsChloroplasttransformation,Geneticengineering,Vaccinesproduction

世界卫生组织2008年公布：

在发展中国家，每年由传染性疾病引起的死亡人数高达950万。

疫苗作为目前最有效的防范治疗传染性疾病的武器，在发展中国家远不能满足需求量。

当前，疫苗主要是通过细菌、酵母和昆虫类细胞的发酵生产（Danielletal.,2009），不仅生产成本高，不易储存和运输，且具有潜在的安全性问题等，其生产附带物内毒素与热原质的纯化过程也相当复杂（Anderson,2010），诸多因素限制了传统疫苗的广泛应用。

随着分子生物学的发展，植物转基因技术如日中天。

植物作为可再生资源，能够通过基因改造来表达外源蛋白，并提供正确组装、折叠所需要的分子伴侣等。

利用植物生物反应器表达疫苗的研究日臻成熟并展示出操作方便、成本经济及应用范围广等优势。

然而传统的核基因组转化中外源基因的表达效率偏低，及转基因的逃逸现象成为现阶段限制植物疫苗发展的瓶颈环节，而叶绿体转化技术的兴起与发展，为将来生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路。

它突破了核基因组转化外源基因表达低效、易随花粉逃逸两大障碍，具有高效表达、定点整合和母性遗传等优点（Maliga,2002;Wangetal.,2009;BockandWarzechr,2010;Cuietal.,2011;MaligaandBock,2011）。

本文在对叶绿体转化技术简要介绍的基础上，阐述了叶绿体转化在疫苗抗原的高效表达和物种扩展方面的研究进展，重点对近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原进行综述，对叶绿体转化技术在表达外源蛋白方面存在的问题进行分析，并探讨植物疫苗研究的未来发展方向。

1叶绿体遗传转化技术概述

1988年Boynton等（1988）用野生型叶绿体DNA转化衣藻突变体，使其光合能力完全被恢复，首次证明叶绿体基因组可以被转化。

历经20多年的研究与发展，叶绿体基因工程在技术和应用上都取得了可喜的进步，以下仅对叶绿体遗传转化的原理、转化方法及其优点进行简要介绍。

1.1叶绿体遗传转化的原理

叶绿体转化是对植物叶绿体基因组进行的遗传转化，基本原理是通过目的基因两端连接的叶绿体同源片段与叶绿体基因组发生同源重组双交换，将目的基因整合进入叶绿体基因组，并经转录、翻译、折叠和修饰等获得功能产物。

成功的叶绿体遗传转化有3个技术关键：

第一，构建表达载体时使用叶绿体来源的调控序列实现外源基因在叶绿体的高效表达。

叶绿体中外源基因的表达水平受启动子及5'非翻译区（5'-un-translatedregions,5'-UTR），包括核糖体结合位点等元件的调控（GruissemandTonkyn,1993），用来保证目的基因能转录成高水平的mRNA。

叶绿体16SrDNA基因的强启动子Prrn（Kotaetal.,1999）和光系统Ⅱ作用中心的启动子PpsbA（Staubetal.,2000）是最常使用的启动子；其次，目的基因阅读框两侧的5'-UTR和3'非翻译区（3'-untranslatedregions,3'-UTR）的序列或结构因子可以与特异蛋白质结合而影响RNA的成熟和稳定性，并成为影响转基因翻译的关键。

通常在构建叶绿体表达载体时选用叶绿体基因psbA的5'-UTR和3'-UTR（VermaandDaniell,2007），保证转基因的高水平翻译。

第二，同源重组实现目的基因的定点整合。

在构建叶绿体表达载体时，为避免位置效应，且不破坏叶绿体基因的原有功能，通常选用叶绿体基因组中相邻的两个基因作为同源重组片段（一般为1~2kb），两基因间隔区作为外源基因整合位点。

外源基因可以在叶绿体环状基因组的多个位点上表达，到目前为止，叶绿体转化使用过的位点有16个，如rbcL/accD、trnV/rps7、psbA/trnK、atpB/rbcL等（Cuietal.,2011;MaligaandBock,2011）。

第三，叶绿体转基因个体基因组的同质化是其稳定遗传的前提。

叶绿体基因组的高拷贝是其优点，也是其缺点，高拷贝性决定了外源基因几乎不可能同时转化所有叶绿体基因组，极易出现转化的与未转化的叶绿体组成的异质体。

为了保证转基因在后代中的稳定遗传，在转化过程中必须淘汰未被转化的叶绿体基因拷贝，通常在构建叶绿体表达载体时连入筛选标记基因，转化后在高浓度选择压力下进行多轮次抗性筛选，从而实现叶绿体基因组的同质化（Kittiwongwattanaetal.,2007）。

aadA基因是目前叶绿体转化中应用最广泛、筛选效率最高的抗生素类筛选标记基因（SvabandMaliga,1993），其编码的氨基糖苷-3-腺苷酸转移酶能使转化植株具有壮观霉素和链霉素抗性，在筛选过程中能够将绿色的转化细胞和白化的非转化细胞区分开。

此外，nptⅡ基因（Carreretal.,1993）、neo基因（KurodaandMaliga,2001）、细菌bar基因（Lutzetal.,2001）等也相继用作叶绿体转化的筛选标记基因，但转化效率均较aadA基因要低很多，目前仍以aadA使用最为广泛。

1.2叶绿体遗传转化的方法

用于叶绿体遗传转化的方法主要有：

农杆菌介叶导法、基因枪轰击法、PEG融合法、花粉管导入法、显微注射法和电激法。

其中使用最多、最成熟、最高效的方法是基因枪法，即将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压作用下被高速射入受体细胞或组织。

这一方法适合于不同植物，转化频率高。

应用基因枪法已成功进行十多种植物的叶绿体转化（Wangetal.,2009），如烟草（Nicotianatabacum）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）、番茄（Solanumlycopersicum）、胡萝卜（Daucuscarota）、莴苣（Lactucasativa）和油菜（Brassicacampestris）等，其中转化效率最高的是模式植物烟草，这一定程度上取决于受体植物是否拥有高频率的离体再生体系。

1.3叶绿体遗传转化的优势

植物叶绿体转化是将外源基因插入叶绿体基因组中进行表达，它具有核转化不具备的独特优势（Maliga,2002;Wangetal.,2009;BockandWarzechr,2010;MaligaandBock,2011;Cuietal.,2011）：

（1）叶绿体基因组的高拷贝性使外源基因的表达水平高；

（2）外源基因的定点整合能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题；（3）叶绿体基因组的原核特性使外源基因可以原核方式表达，这为多基因操作提供了方便，可以多顺反子形式向叶绿体基因组中同时引入多个外源基因；（4）