分子生物学实验技术实验内容概要.docx

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分子生物学实验技术实验内容概要

2006年《分子生物学实验技术》实验内容

一、RT-PCR

（一）总RNA的提取

实验安排：

每两人抽提一管。

为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：

1、将100μl液体样品加入1.5mlEp管中，再加入900μl冰预冷的LS-BiotragentsTM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。

8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-FreeWater）将RNA溶解并于-20℃保存。

注意事项：

1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1%DEPC水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

（二）反转录

实验安排：

每人做一管。

反应体系（20μl）：

按下列顺序加样

5×Buffer

4μl

dNTPs

6μl

RNA酶抑制剂

1μl

Oligo（dT）

1μl

随机引物

1μl

反转录酶AMV

1μl

提取的RNA

6μl

总体积

20μl

反应条件：

42℃1h

注意事项：

1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。

如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。

2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20℃，以防酶失活。

（三）PCR

实验安排：

每人做一管。

反应体系（50μl）：

按下列顺序加样

ddH2O

32.7μl

10×PCRBuffer

5μl

dNTPs

4μl

P1

2μl

P2

2μl

Taq

0.3μl

cDNAtemplate

4μl

Total

50μl

反应程序：

预变性94℃2min

变性94℃30s

退火50℃45s

延伸72℃1min

30cycles

终延伸72℃10min

PCR产物的检测：

琼脂糖凝胶电泳

1、电泳缓冲液TBE（10×）的配制：

称取Tris-base54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。

2、1.5%琼脂糖凝胶的配制：

称取1.5g琼脂糖于三角瓶中，加入10ml10×TBE缓冲液，并加水定容至100ml，加热溶解后加入5μlEB（10mg/ml），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。

3、电泳检测：

取PCR产物5μl与LoadingBuffer1μl混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μlDL2000DNAMarker作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。

注意事项：

1、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。

2、禁止将盛有EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB污染的手套随意拿其它无EB的试剂或仪器。

（四）PCR产物的纯化

实验安排：

每两人的PCR产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A.GelExtractionKit）回收目的DNA。

操作步骤：

1、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好重量的空1.5mlEp管中。

2、将装有胶粒的Ep管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。

3、按1g胶加1ml的量加入BindingBuffer，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep管2－3次，使胶粒完全溶解。

4、将上述溶胶液加入到HiBindspin-column中，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

5、加入300μlBindingBuffer，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

6、加入750μlSPWBuffer，静置2min，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

7、重复步骤6。

8、空管10000×g离心1min，以弃去DNA回收柱中的残余液体。

9、将DNA回收柱放入新的1.5mlEp管中，并加入30μlDNAElutionBuffer至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。

注意事项：

1、电泳时应换用新配制的TBEbuffer，否则会由于电泳缓冲液pH升高而降低DNA的产量。

2、在切下含目的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜（如一次性手套），使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。

4、DNA的洗脱效率与ElutionBuffer的pH有关，因此用ddH2O洗脱DNA时，应调节ddH2O的pH值至8.0。

二、基因的克隆

（一）DNA片断与载体的连接

本实验做PCR回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。

TA克隆原理：

利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR产物的克隆和测序。

实验安排：

每两人做一管。

反应体系（10μl）：

LigationSolutionI5μl

PCR回收产物4.5μl

pMD-18Tvector0.5μl

总体积10μl

反应条件：

16℃4h以上

（二）感受态细胞的制备

实验安排：

每人做一管。

试剂配制：

1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：

称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2、0.1mol/LCaCl2溶液：

称取1.11gCaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100ml，高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌。

3、无菌甘油：

取甘油100ml，高压灭菌即可。

操作步骤（无菌操作）：

1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种于2mlLB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，作为一级种子。

2、将一级种子按1:

50比例无菌转接到5mlLB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养约2h-3h，至细菌的OD600达到0.5左右。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5mlEp管中，冰浴30min。

4、4℃4000r/min离心10min，弃上清。

5、加入1ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，继续冰浴15min－30min。

6、4℃4000r/min离心10min，弃上清。

7、沉淀中加入200μl用冰预冷的0.1mol/LCaCl2轻轻重悬。

悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，分装100μl/管，-70℃保存备用。

注意事项：

1、细胞生长状态：

不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。

2、细胞生长密度：

以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5，细胞密度在5×107个/ml左右（不同菌株情况有所不同）时比较合适。

密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。

3、试剂的质量：

所用的试剂，如CaCl2等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最好于-20℃分装保存。

（三）连接产物的转化

实验安排：

每人做一份。

试剂配制：

1、氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）母液：

用灭菌的ddH2O将氨苄青霉素粉配成100mg/ml水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，置-20℃保存备用。

2、LB液体培养基（Amp＋）：

在LB液体培养基中加入1μl100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。

3、LB固体培养基（Amp＋）：

在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。

待培养基温度降至50℃左右，加入1μl100mg/ml的氨苄青霉素母液后，铺制平板。

待培养基凝固后，于4℃保存备用。

操作步骤：

1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5µl，轻轻混匀，冰浴30min。

2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。

3、加入400µlLB液体培养基，37℃200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。

4、4℃4000r/min离心5min，弃去上清400µl，将剩余的100µl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。

注意事项：

1、质粒的浓度：

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。

一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。

3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。

对照组1：

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：

以质粒代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应出现大量菌落。

（四）质粒的抽提

实验安排：

每人抽提一管，采用质粒快速提取试剂盒进行。

实验原理：

本试剂盒所带Resin质子化以后，具有在高盐、低pH值情况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的性质。

试剂组成：

1、离心柱（50个）：

柱上含Resin（树脂），最大吸附量15µg，4℃保存。

2、溶液A（0.6m1）：

RNaseA10mg/m1，-20℃保存。

3、溶液B（9m1）：

50mMTris/HCl，10mMEDTA，10mg/m1溶菌酶，pH8.0，4℃保存。

4、溶液C（18m1）：

1％SDS，0.2MNaOH（室温低于15℃时会有沉淀析出，加热溶解即可）。

5、溶液D（24m1）：

4M盐酸胍，0.75MKAcpH4.6。

6、溶液E（12ml）：

洗