蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用.docx

蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用.docx

《蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用

蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用

摘要:

蛋白质芯片技术是采用微阵列方法,对样品蛋白进行高通量、高灵敏度、高特异性的分析技术,作为一种新的技术,日益受到人们的关注。

它不仅是蛋白质组学研究中强有力的工具,也是临床应用中疾病早期诊断、预后和治疗效果评测的新手段,其研究成果拓宽了与人类健康更加贴近的应用领域。

蛋白质芯片技术应用于食品安全检测有独特的优势，定会在该领域获得广泛的应用。

关键词：

蛋白质芯片；食品安全；检测；应用

TheApplicationoftheProteinbiochipTechniqueinFoodSafetyDetection

Abstract:

Theproteinchiptechnologyismicroarraymethods,highthroughpu,thighsensitivityandhighspecificityoftheanalysistechniquesfortheproteinsamples.Asanewtechnology,wepaymoreandmoreattention.Itisnotonlyapowerfulresearchtoolsfortheproteomics,butalsoanewmeansofearlydiagnosis,prognosisandtreatmentevaluationintheclinicalapplication,theresultsoftheirresearchesbroadentheapplicationswithhumanhealth.Proteinbiochiptechnologyhasuniqueadvantagesinapplicationoftestingfoodsafetyanditcanbewidelyusedinthisarea.

Keywords:

proteinchip;foodsafety;detection;application

生物芯片是21世纪一项革命性的技术,包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室3个领域,其中蛋白质芯片（proteinchip）是一种高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术。

有关试验表明,该技术对多种疾病的早期诊断均有一定的作用。

它是继基因芯片后发展起来的一项高新技术,近年来又与色谱、质谱、凝胶电泳等联用,为阐明疾病的发生、发展机制及疾病的诊断和药物筛选提供前所未有的新信息,具有广泛应用前景和强烈社会需求。

国内外投入大量人力、物力进行蛋白质芯片的研发。

瑞典的SPR（Surfaceplasrrlonresonance）,美国的SELDI（SurfaceEnhancedLaserDesporptionIonization）及我国的光学代表作芯片技术已经获得实际应用[1,2]。

但目前蛋白质芯片技术还不如基因芯片成熟,在制备工艺和检测方面还需进一步优化。

随着该技术的不断完善,对生物学、医学、环境监测、食品检测等将产生巨大的影响。

本文就蛋白质芯片技术及其在食品安全检测中的应用作简要介绍。

1　蛋白质芯片技术概论

1.1蛋白质芯片技术的定义

蛋白质芯片技术是指把制备好的已知蛋白质样品（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）固定于经化学修饰的玻璃片、硅片等载体上,蛋白质与载体表面结合,同时仍保留蛋白质的物理和化学性质。

根据这些分子的特性,通过蛋白质芯片技术可以高效大规模俘获能与之特异性结合的待测蛋白质,经洗涤、纯化后,再进行确认和生化分析。

蛋白质芯片分析本质上就是利用蛋白质之间的相互作用,对样本中存在的特定蛋白质进行检测。

1.2蛋白质芯片技术的原理

其原理是将位置和序列已知的蛋白以预先设计的方式固定在尼龙膜、玻璃、硅片等载体上,组成密集的分子排列,当荧光、免疫金等标记物的靶分子与芯片上的探针分子结合后,通过激光共聚焦扫描或光耦合元件（CCD）对标记信号的强度进行检测,从而判断样本中靶分子的数量以达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的[3]。

1.3蛋白质芯片技术的特点

蛋白质芯片的特点为：

①高通量，高效率；②蛋白质芯片是一个动态的技术流程概念，不局限于某个固相有形物；③适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品；④芯片上的样品包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广；⑤芯片上的结合物分别经过不同的方法检测，灵敏度高达pg/ml；⑥开放性的芯片平台设计，可以用各种型号的DNA芯片扫描仪进行检测．综合上述特点，决定了蛋白质芯片有着广泛的应用潜力和前景[4]。

2．蛋白质芯片的分类

蛋白质芯片按照不同的标准可进行不同的分类：

2.1按照样品的结合方式分为化学型和生物化学型

化学型蛋白质芯片来源于经典色谱（反相层析、离子交换层系、金属螯合层析等）的介质．通过介质的疏水力、静电力、共价键等结合样品中的蛋白质，然后经特定的洗脱液除去杂质蛋白质，从而保留目标蛋白质[5]。

这种芯片的特异性较差，但是目前仍占已商品化并得到广泛使用的蛋白质芯片的大部分．生物化学型蛋白质芯片把生物活性分子（如抗体、受体、配体等）通过生化反应结合到芯片表面，用于捕获样品中的靶蛋白．这种芯片具有高度的特异性及生物活性分子的多样性，其应用范围和前景明显优于化学性蛋白质芯片．但由于蛋白质比DNA难合成，更难于在固相支持物表面合成，且定位于固相载体表面的蛋白质容易因空间构象的改变而失活，造成了该类芯片的开发应用与商品化落后于化学型芯片。

2.2按点样蛋白质有无活性功能分为无活性的和活性芯片

无活性的芯片是将已经合成好的蛋白质点在芯片上。

其制作方式主要分为原位合成、点合成、光蚀刻术三类。

有活性的芯片是指点在芯片上的样品是活的生物体（如细菌），在芯片上原位表达蛋白质。

相对于无活性的芯片，有活性的芯片可以提供模拟的机体内环境，对于蛋白质功能分析更为有利。

2.3按作用和点样的顺序分为蛋白质表达芯片（PEC）和蛋白质功能芯片（PFC）

PEC能令人通过观察在不同条件下哪种蛋白质被合成而获得基因表达的详细信息。

PEC目标与DNA芯片相类似，它将大量检测用的分子（常用抗体）固着在芯片表面而进行微阵列式排列，故加样后就能查明样品中有无这些分子的靶标．特别是当与较传统的蛋白质功能分子和以核酸为基础的基因表达分析技术综合应用时，其优势将会更明显地体现。

主要用于蛋白质功能的研究[6]。

PFC与PEC都需要有大量不同分子在芯片表面各分散的点上固着，随后加样进行检测。

不同的是，PFC能分析众多蛋白质的性质。

PFC表面上固着的是待测蛋白质分子，随后再用其他蛋白质、药物和生化试剂来检测各待测分子与它们结合的情况并了解其性质。

主要用于蛋白质的定性、定量测定。

2.4按载体的不同进行分类

蛋白质芯片可以分为普通玻璃载体芯片、多孔凝胶覆盖芯片、微孔芯片等[7]。

2.5按检测方法进行分类

较有代表性的有单元芯片、中科院力学所得多元蛋白质光学芯片和美国SELDI质谱芯片等。

它们的差异仅仅在探测方法不同。

BLACORE技术利用表面等离子体共振技术检测芯片，进行单一蛋白质检测；多元蛋白质光学芯片是光学成像法，可以同时检测多种混合的蛋白质；SELDI技术则是采用质谱法，以时间顺序检测序列蛋白质。

2.6按工作原理分为探针型和凝胶电泳型芯片

探针型类似于DNA芯片，即在固相支持物表面高度排列的探针蛋白质点阵，可特异捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量的分析。

凝胶电泳型是在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片的孔道分离开来，经过喷雾直接进入质谱进行检测，以确定样品中的蛋白质分子量及种类[8]。

3蛋白质芯片的制备及分析过程

3.1载体的选择

用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶状态行使功能的固相材料统称为载体。

制作蛋白芯片的载体材料必须符合下列要求:

1）载体表面有可以进行化学反应的活性基团,以便于蛋白分子进行偶联;2）探针固定后能够保持蛋白质的活性;3）使单位载体上结合的蛋白分子达到最佳容量;4）载体具有良好的生物兼容性;5）载体应当是惰性的,并且有足够的稳定性,包括物理、化学和机械的稳定性;6）不同批次基片之间以及同一基片各点之间均一性好[9]。

目前已用于制作蛋白质芯片的载体主要有各种化学膜、聚丙烯酰胺凝胶、多孔硅胶、玻璃片、云母、硅片、金片等。

玻璃片具有表面光滑、成本低、性能稳定等优点,已经被广泛应用于蛋白质芯片的制作。

3.2抗体或抗原的固化

抗体或抗原的固化方法主要有2种:

化学性、生物性。

化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等;生物性配基包括受体、配体、酶、抗体、抗原等。

它们的相应检测对象分别是:

配体、受体、底物、抗原抗体结合蛋白。

待固定的生化分子（配基）可通过化学键直接固定,也可不直接通过化学键固定于载体上,而是先将能与之特异结合又不干扰其活性的分子偶联载体上,再通过专一性、高亲和力作用间接固定配基。

3.3探针蛋白的制备

抗体是最广泛使用的探针蛋白,传统的杂交瘤细胞技术用于单克隆抗体的研制所需时间长,产量低,已经不能满足芯片生产的需要,因此,目前已经着力发展的噬菌体抗体库技术和重组抗体库技术将在探针蛋白的生产中发挥重要作用。

利用96微孔板和高亲和力标签融合蛋白的自动化蛋白质生产也能提供更多的探针蛋白[10]。

3.4蛋白质的预处理

蛋白质芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性,是蛋白质芯片发展的瓶颈技术。

通常点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解,一般是采用含40%甘油的磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶解蛋白质,这样即可以防止水分的蒸发,又可防止蛋白质变性,以保持其固有的生物活性。

3.5芯片的点印

芯片的点印方法一是用手工点样制备低密度蛋白质阵列;二是用阵列针头点样制备蛋白质芯片,这种方法在操作中将蛋白质吸附在针头上,通过针头与固相介质的接触将蛋白质点到介质表面形成阵列;三是用喷墨打印头将蛋白质样品喷点到固相介质上形成阵列。

其中后两者是用机器精确控制的,能够高效率制备较高密度的蛋白质芯片,是今后制作高密度蛋白质芯片的主要方法。

3.6蛋白质的固定

以玻片为载体的芯片固定时放入湿盒中,37℃恒温1h即可;醛基修饰的玻璃芯片固定是通过醛基和蛋白质中的氨基共价结合来固定的。

3.7芯片的封阻

封闭液通常使用含1%小牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液,其目的是封闭芯片上未结合配基的基团,以减少其他蛋白的非特异结合。

3.8蛋白质芯片的检测

3.8.1间接检测法

样品中的被检测物质要预先用标记物进行标记,与蛋白质芯片发生特异性的结合后,使用特定的检测或扫描装置将信号收集,再经计算机分析处理。

目前,标记物主要包括荧光物质、化学发光物质、酶及同位素等。

应用最广的是荧光染料标记,其过程是用荧光染料Cy3或Cy5直接标记待检测的蛋白质,或标记该蛋白质的二抗,和芯片上的蛋白质结合后,用激光扫描和CCD照相技术对激发的荧光信号检测,再用计算机和相应的软件系统进行分析。

其突出优点就是简捷、直观,不足之处在于易产生蛋白质间的非特异性作用,且标记物的加入可能会降低分析的准确度。

3.8.2直接检测法

因为标记分子有可能会影响蛋白质活性,作为直接检测法的无标记模式,如SELDI技术、表面等离子共振技术（SPR）、光学蛋白质芯片技术、原子力显微镜等在蛋白质天然活性检测方面有着特别的优势。

4.蛋白质芯片在食品安全检测中的应用

食品是否安全是一个全球性的问题。

随着农产品和食品生产中新技术、新原料、新产品的采用,造成农产品和食品污染的因素日趋复杂化,而且国内外经常发生农产品和食品生产流通环节中的诸