整理细胞生物学实验指导.docx

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整理细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导

西北农林科技大学生命科学学院细胞生物学教研室

二00九年十月

实验一叶绿体的分离与荧光观察

一.实验目的

1.通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法.

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法.

二.实验原理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。

将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。

然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。

若停止供能，荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。

本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。

因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。

另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

三.实验用品

1.器材：

1）主要设备:

普通离心机,粗天平,荧光显微镜；

2）小型器材:

剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管,10ml刻度离心管,纱布若干,无荧光载玻片和盖玻片。

2.材料：

新鲜菠菜。

3.试剂：

0.35mol/L氯化钠溶液,

0.01%吖啶橙（acridineorange）.

0.01%吖啶橙的配制：

称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4℃冰箱保存。

放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。

吖啶橙（AcridineOrange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。

阻断滤光片波长515nm。

它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

四.实验方法

1.叶绿体的分离

（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;

（2）加10ml的0.35mol•L-1NaCl溶液研磨匀浆;

（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;

（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;

（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；

（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。

2.叶绿体的观察

（1）取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

（2）在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。

（3）在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。

（4）取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。

五.注意事项：

要得到完整的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立即观察。

六．作业：

1.描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？

2．叶绿体分离的原理是什么？

操作过程中应注意什么？

实验二吖啶橙（acridineorange）染色

观察口腔上皮荧光

一．目的要求

1.熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。

2.观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。

二．实验原理

吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。

其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。

三．实验用品

1．器材：

荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；

2．材料：

口腔黏膜上皮细胞临时制片；

3．试剂:

1）0.1mol/LpH7.0PBS液。

A液：

NaH2PO4·H202.76g加蒸馏水至100ml；

B液，Na2HPO4·7H205.36g加蒸馏水至100ml；

取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl8.5g用蒸馏水稀释至100ml。

2）0.1％吖啶橙原液：

0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。

临用时配制0.01％吖啶橙染液：

将0.1％吖啶橙原液用PH7.0PBS液稀释。

3）95％乙醇

四．方法与步骤

1．用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；

2．95％乙醇溶液固定5min；

3．滴加0.01％吖啶橙染液染色5min；

4．用PBS缓冲液缓慢冲洗；

5．加盖玻片镜检。

五．观察结果：

描述你所观察到的实验现象，并绘图，表明荧光的颜色。

实验三PAS（PeriodicAcidSchiff）反应显示糖原

和其它多糖物质

一.实验目的

（一）熟悉PAS法原理及操作步骤；

（二）观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。

二.实验原理

多糖（polysaccharide）是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。

广泛分布于动、植物界。

一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。

另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。

还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内起着重要的作用。

　　淀粉和糖原均由D－葡萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基（-GHO），游离醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物。

三.实验用品

（一）试剂：

1、过碘酸酒精溶液：

取过碘酸（HIO4·2H2O）0.4g溶于35m1纯酒精中，加入5m1的0.2M醋酸钠（醋酸钠2.72g溶于100m1蒸馏水中），再加入15ml蒸馏水。

溶液配好后保存在0℃～4℃的冰箱内，并加黑纸保存，此液如显黄色即失效。

2.Schiff试剂：

将0.5g碱性品红加入100m1煮沸的蒸馏水中，时时摇荡玻璃瓶或者搅拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷却至50℃时过滤到具有玻塞的棕色试剂瓶，加入10ml的lmol／L的HCl，冷却至25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠，在室温黑暗条件下静置24h，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g剧烈振荡摇匀1min；过滤，滤液为无色。

置棕色瓶密封，外包黑纸，4℃保存。

本试剂可提前一天准备，此液必需保持清澈透明、无色也无沉淀，容器要小，装满后仅留很小的空隙，其中不应有任何氧化剂，不要过长时间暴露在空气中。

如有白色沉淀就不能再用，如颜色变红可以加入少许偏重亚硫酸钠，使其再转变为无色就可以再用。

3、亚硫酸水溶液：

取10％偏重亚硫酸钠Na2S2O5（或K2S2O5）20ml、1mmolL-1HCl20ml和400ml纯水混匀即可。

此液使用前配制，否则会因SO2逸出失效。

（此液中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的相同）：

4.苏木精溶液常用的有5种，其中德拉菲氏苏木精染液（Delafield苏木精染液）配法如下:

甲液（苏木精5g、无水乙醇30ml）

乙液（铵矾，即硫酸铝铵饱和水溶液：

比例为1g硫酸铝：

11ml水，用时配110ml,取100ml）

丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。

配法如下：

1.将甲液一滴一滴地加入乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约1周到10天；3.加入丙液；4.将混合液静置2个月至颜色变深为止（可过滤），此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保存使用，使用时可将染剂1份用3～5份蒸馏水稀释，则染色后分化更明显。

５．梯度乙醇溶液：

100％，95％，90％，80％，70％，50％各两份。

一份用于脱腊复水，一份用于脱水。

６．二甲苯

7.100%乙醇+二甲苯（1：

1）

（二）用具：

载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片

（三）材料：

土豆；小鼠肝细胞石蜡切片；

四.实验步骤

（一）土豆切片的观察

制作土豆徒手切片→过碘酸处理15～30min→70%乙醇1min→schiff试剂15min→亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→镜检

（二）小鼠肝细胞切片的观察

　　取鼠肝石蜡切片→二甲苯脱蜡约10min→二甲苯+100%乙醇（3min）→梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100％，95％，90％，80％，70％，50％）中约2～3min→过碘酸氧化15～30min→蒸馏水漂洗→Schiff试剂15～30min→亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→苏木精染色10min→流水冲洗→梯度乙醇脱水（50％，70％，80％，90％，95％，100％），在各乙醇浓度中约2～3min→100%乙醇+二甲苯2～3min→二甲苯适度透明→指甲油封片→镜检

五.作业

1、为所观察到的土豆切片和鼠肝切片绘图，标注其多糖的位置，并描述这两种细胞的多糖分布特点。

2、影响PAS反应染色效果的关键步骤是什么？

3、如何制作徒手切片？

应注意什么才能得到薄而均匀的切片？

六．注意事项

1.过碘酸氧化作用时间稍长，会使反应更加充分。

2.Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过长将导致染色太深，也不利于观察。

3.二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气，后者以透明为准。

如果片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。

4.试剂重复使用后，实验结果不明显（脱蜡不完全、染色不好等），因此在实验

要检查各试剂是否干净，如果污染严重，一定要更换。

实验四PEG法诱导细胞融合

一．实验目的

1.了解细胞融合的原理和过程；

2.初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。

二．实验原理

细胞融合，即在自然条件下或利用人工法（生物的、物理的、化学的），使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。

由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。

 化学融合方法一般使用聚乙二醇（PEG）诱导细胞在体外进行融合。

商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞融合剂。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。

因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。

该方法的优点是：

操作简单，容易获得融合体，融合效果好。

细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合的细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示。

三．实验用品

1．器材:

离心