玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用.docx

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玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

玉郎伞多糖对过氧化氢诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

作者：

段小群，焦杨，张士军，黄仁彬

【摘要】目的研究玉郎伞多糖（YLS）对H2O2诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机理。

方法采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2体外诱导肝细胞损伤，检测培养上清液中AST和ALT水平，测定肝细胞中MDA和GSH含量，MTT法检测细胞存活和增殖活性。

结果YLS（0.125～1mg/ml）可明显降低或恢复由H2O2升高的培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞中MDA含量，还可提高H2O2降低的肝细胞存活率和GSH含量。

结论提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用，该作用可能与其抗氧化作用有关。

【关键词】玉郎伞多糖；肝细胞；过氧化氢；抗氧化作用

　　Abstract：

ObjectiveTostudytheprotectiveeffectanditsmechanismofYulangsanpolysaccharide（YLS）onprimaryculturedrathepatocytesinjuryinducedbyH2O2.MethodsTheprimaryrathepatocyteswereisolatedbyperfusionwithIVcollaganaseandinjuredbyH2O2.Thecontentsofmalondialdehyde（MDA）andglutathion（GSH）inhepatocytesandthelevelsofASTandALTinculturalsupernatantweredeterminedbygeneralmethods.CellviabilitywasassayedbyMTTmethod.ResultsTheelevationofMDAcontentinhepatocytesandASTandALTlevelsinsupernatantofculturalhepatocytes,andthedecreaseincellviabilityandGSHcontentinducedbyH2O2wererestoredremarkablybythetreatmentwithYLS（0.125～1mg/ml）.ConclusionTheresultssuggestthatYLSpossessesdirectprotectiveactiononprimaryhepatocyteinjuryinducedbyH2O2.Thismightbeassociatedwiththeanti-oxidativeactivityofYLS.

　　Keywords：

YulangsanPolysaccharide（YLS）;Hepatocyte;H2O2;Anti-oxidativeactivity

　　玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药，为蝶型花科植物疏叶岩豆MillettiapulchraKurzvar.laxior（Dunn）ZWei的块根。

具有散淤、消肿止痛之功能，民间用于高血压、肝炎、消化不良等的治疗，本课题组经多年研究证实玉郎伞提取物具有抗氧化和免疫调节作用，并对急、慢性实验性肝损伤均有明显的保护作用［1，2］。

玉郎伞多糖（YulangsanPolysaccharideYLS）是玉郎伞提取物中主要的有效成分，为进一步研究YLS对肝损伤的作用，本文采用IV型胶原酶灌流法分离肝实质细胞进行体外培养，用过氧化氢（H2O2）诱导肝细胞损伤模型进行体外研究，观察YLS对体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。

　　1器材

　　1.1动物Wistar大鼠，雌雄不拘，体重（230±30）g；由广西医科大学实验动物中心提供。

实验动物生产许可证：

SCXK桂20030003，实验动物使用许可证：

SYXK桂20030005。

　　1.2药物及试剂YLS，由本室自行提取（分离得到的YLS多糖经Sephadex-75凝胶柱层析，硫酸-苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法证实为高纯度多糖，纯度95%，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成，红外光谱显示有典型的多糖吸收峰）；IV型胶原酶（Sigma公司）；RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；H2O2（重庆川江化学试剂厂）；维生素E（Sigma公司）；台盼蓝（SigmaT6146，北京拜尔迪生物公司分装）；噻唑蓝（MTT，Amerisco，北京拜尔迪生物公司分装）；DHanks缓冲液（自配）；Hanks缓冲液（自配）；二甲基亚砜（DMSO，天津化学试剂有限公司）；天门冬氨酸转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.3仪器HL2型恒流泵（上海精科实业有限公司）；CO2恒温培养箱（美国ThermoForma，Model311）；TDL802B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；SZX型超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；722s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；450型酶标仪（美国BioRad）。

　　2方法

　　2.1大鼠原代肝细胞的分离及原代培养［3，4］大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，无菌操作下，打开腹腔，将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉，小心分离穿线各一根，门静脉穿刺静脉留置针，退出针芯，结扎牢固。

将留置管连接输液管，开启恒流泵，灌流37℃预热DHank's液，流速15ml/min，迅速剪开下腔静脉放血。

同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。

灌流约10min后，肝脏颜色呈黄白色。

下腔静脉插入硅胶管，结扎牢固。

改用含0.05%IV型胶原酶的Hanks液（37℃预热）15ml/min，约15min后，肝脏软化，压之凹陷不易恢复，迅速取下完整肝脏，连同含胶原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，轻柔摆动肝组织，让细胞慢慢游离出来，200目筛过滤得细胞悬液。

600r/min离心，弃上清，沉淀加1640培养液吹打混匀，800r/min离心，共洗涤两次。

用血球计数板（台盼蓝拒染法）测定细胞活率及细胞密度。

用1640培养液调整细胞密度为5×105/ml，肝细胞活力大于90%。

将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养12h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。

　　2.2YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用［5,6］维生素E作阳性对照，用少量DMSO溶解，加入到培养液后其终浓度为50μmol/ml。

　　取上述贴壁生长的肝细胞，设H2O2模型组、YLS（0.125～1）mg/ml4个剂量组和空白对照组、维生素E组，每组至少设6个复孔。

分别加入H2O20.6mmol/L，不同浓度的YLS,维生素E和溶媒，继续培养24h后，收集培养上清检测AST,ALT活性；弃肝细胞培养上清，加入0.2mlTriton-100水溶液0.5ml，混匀，2500r/min离心10min，取上清测定肝细胞MDA和GSH含量，同时用MTT比色法，测定肝细胞的活率。

　　2.3MTT比色法待测细胞悬液于96孔培养板培养24h后，各孔加入20μlMTT试剂，轻轻混匀，继续37℃培养4h，吸出全部液体，加200μlDMSO，微量振荡器上振荡15min，待溶解完全，于酶标仪570nm波长比色。

　　2.4赖氏法测定AST和ALT按试剂盒说明测定。

　　2.5MDA和GSH含量测定按试剂盒说明测定。

　　2.6数据处理所有数据均以±s表示，采用t检验进行统计处理。

　　3结果

　　结果见表1。

　　3.1YLS对H2O2损伤肝细胞ALT和AST活性的影响H2O2损伤肝细胞后，促进肝细胞内酶的释放，模型组的ALT，AST水平较正常组明显升高，YLS在（0.125～1）mg/ml剂量范围内，能显著抑制H2O2损伤肝细胞后ALT，AST水平的上升，并呈明显的剂量依赖性；VitE也能明显抑制H2O2损伤肝细胞后ALT，AST水平的上升。

　　3.2YLS对H2O2损伤肝细胞MDA和GSH的影响H2O2损伤肝细胞后，肝细胞中的MDA明显升高，GSH则显著降低，除YLS0.125mg/ml外，其余YLS各剂量组均能显著提高H2O2损伤肝细胞中的GSH含量和降低H2O2损伤肝细胞中的MDA含量，并呈明显的剂量依赖性；VitE对H2O2损伤肝细胞也具有提高GSH含量和降低MDA含量的作用。

　　3.3YLS对H2O2损伤肝细胞活性的影响MTT法测定结果表明，H2O2损伤后模型组细胞活性明显下降，YLS在（0.125～1）mg/ml剂量范围内，能显著恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性，并呈明显的剂量依赖性；VitE也能恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性。

　　表1YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用（略）

　　与H2O2组比较，*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=6

　　4讨论

　　在肝细胞损伤过程中,氧自由基（oxygenfreeradical，OFR）起了重要作用。

OFR及其诱发的脂质过氧化物（LPO）可引起激烈的链式反应，产生几十种毒性分子，再次诱发成更多的OFR，继而加速加重肝细胞膜、细胞器、蛋白质以及DNA的损伤［7］。

　　本实验应用H2O2诱导肝细胞损伤，H2O2可直接弥散入细胞内与各种细胞成分相互作用，且在富含铁的肝细胞内也转变为OH·，OH·等自由基可致DNA键断裂，并与细胞的重要成分起反应，亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸（PUFA），引发膜脂质过氧化链式反应。

双链脂肪酸过氧化（聚合）导致MDA形成增多，肝细胞膜通透性增加，使ALT与AST释放增加［8～11］。

同时H2O2可促进GSH等抗氧化物消耗增多而水平下降，清除自由基功能也下降，损伤进一步加重。

据此，本实验选择培养上清中ALT与AST，肝细胞MDA含量和GSH水平作为评价肝细胞损伤的指标。

　　实验表明，H2O2损伤导致肝酶变化，如反映肝细胞损伤的AST，ALT均明显升高。

在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，随YLS剂量加大，细胞培养上清中的肝酶活性进行性降低，提示YLS能减轻肝细胞损伤，减少ALT与AST的释放。

实验证明，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能降低肝细胞内的MDA含量，提示YLS能有效对抗H2O2引起脂质过氧化作用，减少脂质过氧化物的形成。

研究显示，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能恢复肝细胞内的GSH含量，提示YLS能有效恢复抗氧化物水平和清除自由基功能。

MTT比色法测定肝细胞存活率显示，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能恢复和提高H2O2损伤肝细胞后的细胞存活率。

　　综上所述，研究表明YLS对H2O2损伤的肝细胞具有保护作用。

其机制可能为YLS通过对抗H2O2引起的脂质过氧化作用，从而保护肝细胞膜和线粒体膜的完整性，使肝细胞免受H2O2产生的自由基引起的肝细胞损害。

【参考文献】

　　［1］焦杨，段小群，黄仁彬，等.玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制和清除