美登木内生真菌产抗癌物质球毛壳甲素的分离及鉴定.pdf

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4讨论4.1在野菊花挥发性成分中,主要为单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物、三萜类化合物和脂肪族化合物等。

萜类化合物是存在于植物界的一类化合物,其生物活性是多方面的,并且是某些中药的主要有效成分。

如在野菊花挥发油中的主要萜类化合物蒎烯、1,82桉叶油素、萜品醇、顺2桧萜醇、侧柏酮、龙脑、乙酸龙脑酯、谷甾醇等活性有效成分,分别具有镇痉、平喘、祛痰、止咳、抗菌、抗病毒、抗癌、驱虫等作用6;某些芳香族化合物如:

姜黄烯、对聚伞素等具有利胆、抗菌、杀虫、杀真菌作用6。

野菊花是一种非常值得开发的、很有前途的药物。

4.2从表1可知:

SFE提取物有148个化合物,已鉴定出60种化合物,占挥发油总量的53.64%;SD提取物有89个化合物,已鉴定出46种化合物,占挥发油总量的57.75%。

实验结果表明SFE提取物与SD提取物在化合物组成及含量上有较明显的差别。

在采用SFE时,由于二氧化碳具有很强的溶解能力,能将野菊花中所含的各种组分有效提取出来;SD提取挥发油时,有些物质如三萜、甾醇由于其分子量大,沸点高,挥发性小而难于提出,再加上高温使某些化合物分解,无法提出原有的真实化合物。

4.3SFE比SD的优点是提取时间短,得率高,有效成分提取完全,不易造成有效成分的分解破坏。

因其上述独特的优点,该方法定会在中药有效成分的提取及质量研究方面得到广泛应用。

参考文献1江苏新医学院.中药大辞典（下册）M.上海:

上海科学技术出版社,1986:

2128,2144.2中国医学科学院药物研究所.中药现代研究（第2卷）M.北京:

北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997:

153159.3袁家谟,陈训,先静缄,等.贵州芳香植物M.贵阳:

贵州科技出版社,1990:

115.4赵树年,陈于澍,谢金伦,等.萜类化合物大全（上卷,下卷）M.昆明:

云南科技出版社,1993:

137,383,396,466,967.5丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用M.北京:

科学出版社,1987:

601602,617619.6国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分分册M.北京:

人民卫生出版社,1986:

132136;165;281;421;824825;832833;904;968;996;1031;1141.（收稿日期:

2001204228）美登木内生真菌产抗癌物质球毛壳甲素的分离及鉴定张玲琪1,王海昆2,邵华1,沈月毛3,曾松荣1,徐成东1,宣群1,魏蓉城1（1.云南省工业微生物发酵工程重点实验室,云南大学生命科学与化学学院,云南昆明650091;2.昆明师范高等专科学校生物系,云南昆明650031;3.中国科学院昆明植物研究所,云南昆明650201）基金项目:

国家自然科学基金资助项目（39860005）;云南省工业微生物发酵工程重点实验室资助项目作者简介:

张玲琪,女,硕士研究生导师Tel:

（0871）5033159E2mail:

yim401摘要:

目的通过植物内生真菌的分离,筛选产生抗癌成分的菌株。

方法从美登木（Maytenushookeri）茎、叶中分离内生真菌,对其发酵产物经活性跟踪（抑菌实验）,其活性成分用薄层色谱、柱色谱纯化及活性跟踪,再经质谱及核磁共振光谱分析确定结构。

结果从美登木中分离筛选到一株球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）:

98M26,其产生抗癌化合物球毛壳甲素（chaetoglobosinA）。

结论美登木内生真菌中,有的内生真菌可产生与宿主所产的美登素（maytensine）不同的抗癌物质。

关键词:

内生真菌;球毛壳菌;球毛壳甲素;美登木中图分类号:

R915文献标识码:

A文章编号:

1001-2494（2002）03-0172-04Isolationanddeterminationoftheanti2cancersubstanceofchaetoglobosinAproducingbyendophyticfungusofinMaytenushookeriZHANGLing2qi1,WANGHai2kun2,SHAOHua1,SHENYue2mao3,ZENGSong2rong1,XUCheng2dong1,XU2ANQun1,WEIRong2cheng1（1.KeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology&FermentationTechnologyofYunnan,LifeSci2enceandChemistryCollege,YunnanUniversity,Kunming650091,China;2.KunmingJuniorNormalCollege,Kunming650031,China;3.KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650204,China）271ChinPharmJ,2002March,Vol.37No.3中国药学杂志2002年3月第37卷第3期1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:

/ABSTRACT:

OBJECTIVEToisolatetheplantendophyticfungiwhichproducesanti2cancersubstance.METHODTheendophyticfungiwasisolatedfromthestemandleafofMaytenushookeri.Theanti2cancercompoundswerestudiedbytheinhibitionagainstPenicilliumavellaneum,TLC,CC,MS,1H2NMRand13C2NMR,respectively.RESULTSAstrainofChaetoniumglobosumwhichwasisolatedfromMaytenushookeriproducedthechaetoglobosinA.CONCLUSIONSomeendophyticfungiisolatedfromM.hookeriproducedtheanti2cancercompoundwhichwasdifferentfromthemaytensineproducedbyM.hookeri.KEYWORDS:

endophyticfungi;Chaetomiumglobosum;chaetoglobosinA;Maytenushookeri1993年,Strobel等1报道了从短叶红豆杉的树皮中分离到一种能产生抗癌化合物紫杉醇的内生真菌,为抗癌药物的研究开发开辟了新的途经。

迄今为止,所见报道均只发现内生真菌产生与宿主相同或相似的生物活性成分,本文首次报道了从美登木叶中分离筛选到一株产球毛壳甲素的内生真菌,表明植物内生真菌也可产生与宿主不同的抗癌物质。

球毛壳甲素是Sekita等23于1983年新发现的抗癌化合物,为细胞分裂抑制剂。

从美登木中分离到产生球毛壳甲素的内生真菌,是一个新的发现。

1材料和方法1.1材料美登木（Maytenushookeri）取材于云南省西双版纳州。

榛色青霉菌UC24376（Penicilliumavella2neumUC24376）作为抑菌实验的检测菌45,由中国科学院昆明植物所提供。

美登素（maytensine）由中国科学院昆明植物所李朝明研究员提供。

1.2培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）,榛色青霉菌UC24376的培养基。

1.3内生真菌的分离及其鉴定取美登木的茎、叶,先用自来水冲洗干净,再用75%乙醇漂洗23s,无菌水冲洗34次,又用0.1%升汞浸泡23min,无菌水冲洗45次。

按无菌操作方法将上述处理过的茎段的一部分植于PDA平皿上作对照培养处理。

剩下的茎段剥弃其木质部,留下的韧皮部剪成0.5cm小段;将上述处理过的叶周边均沿0.2cm剪除,所剩叶片中心部分再剪成长宽约0.5cm左右的小片。

将剪好的茎段和叶片种植于PDA固体培养基上,待茎、叶切面处长出菌丝后,挑取其尖端部分移至新的PDA固体培养基上,经纯化后即得到美登木的内生真菌。

内生真菌的鉴定按真菌鉴定的常规方法进行6。

1.4内生真菌的液体培养于500mL的三角瓶中加入100mL马铃薯葡萄糖培养液,用接种钩各挑取适量内生真菌菌丝接种于三角瓶培养液中,置于28的摇床（110rmin-1）振荡培养56d后即可。

1.5内生真菌产物的提取方法1.6检测菌榛色青霉的制备榛色青霉菌UC24376接入培养皿中培养57d后形成大量的粉末状孢子层,用0.05%聚山梨酯80的灭菌水洗下孢子,制成每毫升约3亿个孢子的悬浮液。

待榛色青霉固体培养基冷至（471）时,取适量的悬浮液加入其中,摇匀后倒平板。

1.7各内生真菌产物的抑菌实验各分别取适量内生真菌发酵液的提取液A和B于滤纸上,待溶剂挥发后,均置于已接种榛色青霉菌的培养皿上,轻压。

将培养皿置于（391）培养24h后观察抑菌结果。

抑菌效果明显的菌株再重复实验。

1.898M26产抑制榛色青霉菌UC24376生长的活性成分的分离和鉴定1.8.1薄层色谱及柱色谱硅胶G层析板、200300目硅胶（青岛海洋化工厂）;4060反向硅胶、TLCplate（德国Merck）;洗脱剂:

氯仿、氯仿2甲醇（955）、氯仿2甲醇（10010）、甲醇;洗脱剂:

丙酮2水（7030）、丙酮2水（8020）、丙酮;洗脱剂:

石油醚2丙酮（8020）、石油醚2丙酮（7030）、丙酮、甲醇;显色剂:

2,5%硫酸2无水乙醇溶液。

1.8.2检测菌榛色青霉菌UC24376。

1.8.3结构鉴定VGAutospec型质谱仪;BRUK2ERDRX2500核磁共振仪（溶剂:

氘代氯仿）。

1.8.4方法美登木内生真菌98M26经液体培养及产物提取（同“1.4”和“1.5”）,得到提取液A,再经371中国药学杂志2002年3月第37卷第3期ChinPharmJ,2002March,Vol.37No.31994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:

/薄层色谱、柱色谱分离及各组分的活性跟踪（抑菌实验）,得到抑菌圈最大的纯品组分,用质谱仪及核磁共振光谱仪鉴定其化学结构。

2结果2.1美登木内生真菌的分离及其液体发酵产物提取物的抑菌实验从美登木茎、叶中分离出12株内生真菌,分别经液体培养,再用各内生真菌发酵液的提取液A和B制备的试纸置于榛色青霉菌的培养皿上,经培养1d后发现:

12株内生真菌的提取液B均无抑菌圈出现;12株内生真菌的提取液A的抑菌结果显示,有7株菌有抑菌圈出现,其中98M26的抑菌圈最大。

2.2美登木内生真菌98M26的形态特征经鉴定,98M26为球毛壳菌（Chaetomiumglo2bosum）6。

其子囊壳205320m205280m,壳壁先呈黄色,后变黑色;顶毛无隔膜,表面有细刺,基部粗茎为3.5m,大部分深榄色,尖端渐纤细,呈黄色至无色,波纹状屈曲;子囊棍棒形,64m13m;子囊孢子8个,深榄褐色,广卵圆形、亚球形以至柠檬形或梭形,9.513m6.39.5m。

其个体形态见图1。

图198M26的个体形态（460）Fig1Thethallusmorphologyofthe98M26（460）2.398M26产抑制榛色青霉菌UC24376生长的活性成分的分离美登木内生真菌98M26用10LPDA液体培养基培养（培养及产物的提取同“1.4”和“1.5”）,得到2.4g浸膏a,用