单克隆抗体电荷异构体分离方法优化.pdf

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中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5385DOI:

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.014技术与方法单克隆抗体电荷异构体分离方法优化程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张弢，王旻单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体1。

这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺2，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段1。

其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。

电荷异构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。

由于这些异构体可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性地识别和分离电荷异构体是至关重要的。

基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：

当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除3。

因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构体含量与原研药保持一致。

在众多分离手段中，离子交换层析被认为是最有前景的方法4。

有研究表明，依赖pH变化的分离方式比依赖离子强度变化的分离方式效果更好5-6。

近年来不断有研究者通过pH梯度洗脱方式分离电荷异构体。

Pabst等7通过控制缓冲液中Tris、双Tris丙烷、组氨酸、乙醇胺的比例，而Farnan和Moreno8通过调节缓冲液中哌嗪、咪唑和Tris的比例，均实现了pH梯度洗脱，成功分离出抗体的电荷异构体，但整个工艺较为复杂，pH控制不稳定。

近些年，置换色谱凭借其出色的分离能力，已成功被应用于分离抗体电荷异构体、寡糖、多肽、小分子化合物。

但商品化的阳离子层析置换剂SachemExpellSP1成本较高，且伴随着碱性异构体的洗脱过程亦有部分置换剂被洗脱9，也带来一定的安全隐患，此外，置换序列的监测是一项耗时、难度较大的工作，这些均阻碍其应用到生产中。

本课题组经CHO细胞表达，ProteinA亲和层析、SP-FF阳离子层析已制备纯度达95%以上的单克隆抗体IgG1，但阳离子层析动态载量较小且洗脱样品酸性异构体含量偏高（20%），不符合质控标准（18%）。

本研究通过层析介质筛选得到动态结合载量高、分辨率好的层析介质。

依据酸性异构体pI（7.23）小于目的组分pI（7.34），参考pH梯度洗脱的原理，在原工艺上增加一步预洗步骤，特异性去除酸性异构体，从而降低最终样品的酸性异构体含量。

1材料与方法1.1材料1.1.1单克隆抗体溶液CHO细胞发酵液经ProteinA纯化，低pH值孵育，并用Tris中和至pH5.8，浓度约9.13mg/ml。

经毛细管等电聚焦电泳测定，酸性异构体pI=7.23，目的组分pI=7.34，碱性异构体pI=7.47。

1.1.2层析柱PorosXS购自美国ThermoFisherScientific公司；NuviaS购自美国Bio-Rad公司；HiTrapSP-FF购自美国GEhealth公司；EshmunoS、Fractogel-EMDSO3-（M）、Fractogel-SEHicap（M）均购自德国Merck公司；HPLC-SEC为美国Sepax-technologies公司产品，保护柱为ZenixSEC-300，50mm7.8mm，粒径3m；分析柱为300mm7.8mm，粒径3m；HPLC-IEC为美国ThermoFisherScientific公司产品，分析柱为PropacWCX-10，250mm4mm。

1.1.3试剂Tris购自美国Amresco公司；NaH2PO4H2O、Na2HPO412H2O、NaCl、HCl等为国产分析纯试剂；纯水由美国Barnstead公司超纯水仪制备。

1.1.4仪器KTApurifier蛋白纯化仪为美国GEHealthcare公司生产，检测波长为280nm；pH计为瑞士MettlerToledo公司产品；Agilent1260型高效液相色谱仪为美国Agilent公司产品；Genesys10UV紫外可见分光光度仪为美国ThermoFisherScientific公司产品；台式高速离心机为德国Eppendorf公司产品。

1.2方法1.2.1介质动态载量测定以20mmol/LPB（pH5.8）为上样缓冲液平衡层析柱，取ProteinA亲和后样品，20mmol/LPB（pH5.8）稀释至2mg/ml，先流经旁路使紫外吸收值达到平台期后，样品进入层析柱，以穿透样品紫外吸收值达到平台期的10%计算动态结合载量（DBC）。

流速与各层析柱体积匹配，使保留时间为1min。

DBC（mg/ml）=（VACO）/VCVA表示穿透样品紫外吸收值为平台期的10%的上样体积；CO表示样品蛋白浓度；VC表示总的柱床体积。

1.2.2各介质分辨率的考察取亲和样品用20mmol/L作者单位：

210009南京，中国药科大学生命科学与技术学院（程洪杰、王旻）；210042南京，江苏先声药业有限公司（程洪杰、马珂、秦国宏、张道平、张弢）通讯作者：

王旻，Email：

;张弢，Email：

zhangtao收稿日期：

2014-03-05386中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5PB缓冲液（pH5.8）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPBpH5.8为上样缓冲液，基于方法1.2.1的结果选择SP-FF、PorosXS、NuviaS三种层析介质，上样量为各介质动态载量的80%，保留时间1min。

20mmol/LPB平衡，030%20mmol/LPB（pH5.8）、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积，保留时间3min。

洗脱峰分阶段收集，UV1001000mAU标记为“ELU-1”；1000mAU最高值标记为“ELU-2”；UV最高值下降至1000mAU标记为“ELU-3”；1000mAU降至100mAU标记为“ELU-4”。

各样品均进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.3pH对抗体质量的影响取亲和样品，20mmol/LPB（pH5.8）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH5.8）为上样缓冲液平衡柱子，上样量为80%DBC，线性流速200cm/h。

以pH分别为6.2、6.5、6.8、7.2的20mmol/LPB平衡后，030%20mmol/LPB、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积。

洗脱峰分阶段收集，进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.4NaCl浓度预洗去除酸性异构体的影响取亲和样品，将pH9.0的1mol/LTris调pH至6.5，20mmol/LPB（pH6.5）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH6.5）为上样缓冲液，分别用1.5%、2%、2.5%的20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl进行预洗，紫外上升至50mAU后收集预洗峰，030%20mmol/LPB（pH6.5）、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积，洗脱峰分阶段收集，进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.5不同电导率PB（pH6.8）缓冲液预洗固定体积去除酸性异构体的影响20mmol/LPB（pH6.8）与200mmol/LPB（pH6.8）混合分别配制预洗缓冲液2.5、3.0、3.5mS/cmPB（pH6.8），同时配制2%20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl。

取亲和样品，1mol/LTris9.0调pH至6.5，20mmol/LPB（pH6.5）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH6.5）为上样缓冲液，分别用上述预洗缓冲液预洗15柱体积，紫外上升至50mAU后收集预洗组分。

20mmol/LPB（pH6.5），200mmol/LNaCl直接洗脱，收集洗脱峰。

各样品进行HPLC-SEC/IEC检测。

1.2.6HPLC-SEC检测蛋白多聚体与碎片含量10样品经超滤换液至20mmol/LPB（pH5.8）中，用纯化水稀释至2mg/ml。

150mmol/LPB（pH7.0）平衡色谱柱，流速1ml/min。

待基线平稳，进样10l，紫外检测波长214nm，记录20min。

1.2.7HPLC-IEC检测蛋白电荷分布10样品经超滤换液至20mmol/LPB（pH5.8）中，用纯化水稀释至4mg/ml。

流动相A为20mmol/LPB（pH6.2），流动相B为20mmol/LPB（pH6.2）、0.3mol/LNaCl。

流动相B清洗色谱柱30min。

92%流动相A、8%流动相B平衡色谱柱至基线平稳，流速0.8ml/min，柱温为25。

进样10l，紫外检测波长为214nm，记录35min。

线性梯度洗脱：

8%35%B，029min；30min之后维持50%B。

1.2.8紫外吸收测定蛋白浓度将待测样品用纯水稀释合适倍数，使在280nm处吸收值处于0.20.8范围内。

蛋白浓度（mg/ml）=（A280nm稀释倍数）/消光系数2结果2.1介质动态载量测定如表1所示，PorosXS与NuviaS均显示出较高的动态载量，均在50mg/ml以上，而其他几种介质载量比较小，故选择PorosXS和NuviaS做为候选介质。

表1介质动态载量测定介质动态结合载量（mg/ml）粒径（m）SP-FF13.9590NuviaS51.7985EshmunoS21.957595Fractogel-SO318.394090Fractogel-SE17.314090PorosXS55.87502.2各介质分辨率的考察以原工艺中的SP-FF作为对照，通过洗脱峰的分段收集，考察各介质分离电荷异构体的差异。

三种介质均只有一个洗脱峰，各电荷异构体洗脱顺序与理论一致11，酸性异构体由于带电荷少最先被洗脱下来，而碱性异构体在目的组分之后被洗脱（图13），对照品HPLC-IEC分析图谱见A（mAU）时间（min）图1单抗对照品分析型离子交换色谱图A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积图2SP-FF层析图谱以及各洗脱组分中酸性异构体比例中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5387A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积图3PorosXS层析图谱及各洗脱组分中酸性异构体比例A（mAU）酸性异构体比例（%