精品靶向MRP1基因pRNATH1461以及shuttleRFP重组质粒表达载体构建毕业论文.docx

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精品靶向MRP1基因pRNATH1461以及shuttleRFP重组质粒表达载体构建毕业论文

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齐齐哈尔大学

毕业设计（论文）

题目靶向MRP1基因pRNAT-H1.1shuttle-RFP重组质

粒表达载体构建

学院

专业班级

学生姓名

指导教师

成绩

2011年6月20日

摘要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。

化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。

肿瘤细胞的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。

肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（MultidrugResistance-associatedProtein1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

目的：

本课题选用pRNAT-H1.1shuttle-RFP表达穿梭载体。

构建针对mrp1mRNA的RNA干扰表达载体。

方法：

将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1siRNA重组质粒。

将重组质粒转化E.coliDH5α后大量提取重组质粒，经菌落PCR和DNA测序分析检测重组载体构建结果。

结果：

成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1shuttle-RFP重组质粒表达载体。

为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。

关键词：

RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFP质粒；穿梭载体

Abstract

Cancer,aseriousthreattotherisingtrend.Chemotherapyastheroutineclinicaltherapyoftumor,whichisanirreplaceablewayincancertreatment.MDRoftumorcellcausethefailureofchemotherapytreatment.ThereasoncausingthecancerMDRisrelativelycomplicated,andtheexcessivelyexpressionofmultidrugresistance-associatedprotein1（MRP1）isoneofthereasonscausingMDR.SilencingMDR1genebyRNAi,wecanimprovetheeffectofchemotherapybydecreasethelevelofMDR.

Objective:

Inthisstudy,pRNAT-H1.1shuttle-RFPplasmidwasselectedtoconstructtheRNAiexpressionvectorofmrp1mRNA.

Methods:

Accordingtomrp1wedesignedandsynthesizedtheDNAfragmentthatwasclonedintopRNAT-H1.1shuttle-RFPvectortoconstructrecombinantvector.TransformedtherecombinantvectorintoE.coliDH5α.TheresultofrecombinantvectorwasanalyzedandidentifiedusingPCRandDNAsequencing.

Results:

ConstructingpRNAT-H1.1shuttle-RFPrecombinantplasmidexpressionvectorwasconstructedsuccessfully.ItmaybethefoundationofrestraintheexpressionofMRP1geneincancercells.

KeyWords：

RNAinterference；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFPplasmid；shuttlevector

目录

摘要I

AbstractII

第1章绪论1

1.1RNAi的研究进展1

1.1.1RNAi的发现过程1

1.1.2RNAi的分子作用机制2

1.1.3RNAi的特点3

1.1.4siRNA简介3

1.1.5siRNA的设计原则3

1.1.6RNAi在抗肿瘤方面的研究4

1.2用于RNAi的载体4

1.2.1载体的选择5

1.2.2质粒人工构建的目的5

1.3MRP1的研究进展5

1.3.1MRP的转运底物、组织分布及生理作用6

1.3.2MRP在组织中的表达6

1.4基因治疗7

1.5本课题在国内外的研究现状7

1.6本论文的研究目的及意义8

1.7本论文的主要内容8

第2章实验材料与方法9

2.1实验材料9

2.1.1宿主菌9

2.1.2质粒载体9

2.1.3载体通用引物11

2.1.4主要试剂及工具酶11

2.1.5主要仪器12

2.2实验方法13

2.2.1shRNA的设计与退火13

2.2.2合成干涉片段的退火16

2.2.3重组载体的构建17

2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子20

2.2.5测序鉴定重组载体21

2.2.6重组质粒大提的OD值检测21

第3章结果与分析22

3.1质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果22

3.1.1质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果22

3.1.2目的片段的回收23

3.2重组载体的菌落PCR24

3.3重组质粒大量提取25

3.4重组质粒测序结果26

讨论29

4.1菌落PCR鉴定重组29

4.2重组质粒穿梭载体的构建29

结论30

参考文献31

致谢34

第1章绪论

1.1RNAi的研究进展

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。

RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。

1.1.1RNAi的发现过程

1990年，RichJorgensan和他的同事在对矮牵牛花进行实验时，无意中发现一种奇怪的现象。

他们尝试把pigment-produing这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果却发现不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。

RichJorgensan把这种现象称为共同抑制，因为导入了外源性基因，使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了[1]。

遗憾的是当时这种现象并未引起Jorgensen的重视。

1994年，Cogoni[2]和Macino采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时，发现真菌中也存在类似的现象，他们称之为基因抑制，这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。

1995年Guo[3]等在对线虫的实验中发现，正义RNA与反义RNA一样可以阻断par21基因的表达，可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究，只做了普通的报道。

直到1998年，关于RNAi现象的研究才被人们真正的发现[4]。

Fire[5]等将双链RNA，即正义链和反义链的混合物，注射到线虫的体内，却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默，要彻底使同源基因的表达沉默，在每一个细胞中，只需要很少的几个分子的双链就可以做到。

在接下来进行的实验中还证实[6]，将双链RNA注入线虫体内后，不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达，同时还沉默了其第1代子代的同源基因，他们从此把这种现象命名为RNAi。

随后，RNAi现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现[7]。

这种情况揭示了RNAi现象可能出现于生命进化的早期阶段，在RNAi机制发现之前，不同生物中的RNAi现象有着不同的描述：

真菌中称为“镇压”作用，在植物中被称为转录后基因沉默和基因协同抑制[8]。

1.1.2RNAi的分子作用机制

RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。

不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：

特异效应作用机制与非特异效应作用机制。

特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。

[9]。

其中，RNAi的特异效应作用机制是在多个不同的水平上实现的，包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。

其中，转录后水平RNA干扰的研究最为深入，应用也最为广泛。

[10]

1.1.2.1特异性效应

转录后水平的RNA干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。

随着科学技术的发展和RNAi研究的深入，人们对RNAi的作用机制的了解也越来越多，通过生化和遗传学研究，现在普遍认为RNAi可能的作用机制主要包括两个阶段：

第一步：

起始阶段，即内源或外源dsRNA经特定的RNaseIII家族的双链特异的核糖核酸酶（Dicer）以ATP依赖的方式将长的dsRNA切割成21～23nt的小干扰RNA；第二步，效应阶段，即siRNA与RNA诱导沉默复合物RISC结合共同降解靶mRNA[11]。

除此之外还有某些研究认为RNAi的作用机制还存在着第三阶段——循环放大阶段。

这是RNAi的自身循环放大机制，其机制主要是指在效应阶段，RISC活化后与mRNA结合，mRNA被内切核酸酶切割成大小在l2～23nt不等的小片段，这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。

同时，释放出来一种可以作为特殊引物的siRNA，从而以靶mRNA为模板在RdRP的作用下，合成新的dsRNA。

这种dsRNA可以降解成新的siRNA，在这个循环中表现出放大效应[10]。

抑制相应mRNA的翻译可阻碍相应的蛋白质表达，这就是翻译水平的RNA干扰机制[12]，其中stRNA起到了非常的重要作用。

转录水平上的RNA机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，从而加强同源DNA的甲基化，以阻碍目的基因转录，使表达关闭，从而强化基因沉默。

有文献谈到组蛋白H3及相应DNA区域可被dsRNA诱导甲基化。

一旦启动子区域出现甲基化，那么转录将被阻断，如编码区出现甲基化，则可以进行转录，但在转录后水平上沉默。

1.1.2.2非特异效应

研究表明，长度大于30nt的长双链RNA转染至哺乳动物体内，dsRNA会激活双链RNA所依赖的蛋白激酶途径[13]，从而导致EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，诱发全面的细胞基因沉默。

1.1.3RNAi的特点

RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。

但由于循环放大机