ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynt.docx
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ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynt
Thermo
SCIENTIFIC
RevertAid™第一链cDNASynthesis试剂盒
#K1621,#K1622
分析证明书
#K1621
Lot
质量控制
采用100fg对照GAPDHRNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行;疑胶电泳和澳化乙锭染色显示得到足够量的496bp的产物
质量认证人:
JurgitaZilinskiene
页码
试剂盒组成.2
存储条件.2
产品说明.2
注意事
项3操
作步骤6
RT-PCR・6
合成cDNA用于克隆7实
验对照.8问
题分析与解决...10
WORD版木
试剂盒成分
RevertAid"第一徒cDNA合成试剂盒
20吹
#K1621
100次
林1622
RevertAid™M-MuLV反转录酶（200u*/“1）
25“1
120“1
RiboLock™RNA酶抑制剂（20
25“1
120“1
5x反应缓冲液
（250mMTris-HCl（pH8.3）,250mMKC1,20niMMgCh,50mM
150“1
500“1
10mMdNTP混合物
50“1
250“1
01igo（dT）i8引物100“M,0.5jug/ju1（15Agoou/ml）
25“1
120“1
随机六聚体引物100//M,0.2“g/“l（6A260u/ml）
25“1
120zzl
GAPDHSL向引物,10
5'-CAAGGTCATCCATGACMCTTTG-3'
20“1
20“1
GAPDH反向引物,10“M
5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
20“1
20“1
对照GAPDHRNA
1.3kb3'-poly（A）tailedRNAtranscript,0.05“g/“l
20“1
20“1
无核酸酶高纯度水
2x1.25ml
2x1.25ml
*一个单位的RevertAidnM-MLV逆转录酶在37°C10分钟将1nmol的dTMP转化为多核苦酸组分（吸附在DE81上）。
**一个单位的RiboLock"RNdse酶抑制剂抑制5ngRNA酶A50%的活性。
存储条件
试剂盒中所有组分应存储在-20"C。
对照用RNA可存储于-70T以便长期使用。
产品说明
RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA»本试剂盒使用RevertAid™M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。
该反转录酶可耐受42-50QC温度，合成的cDNA月段长度达13kb。
试剂盒中含有RiboLock™重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55T高温。
试剂盒同时含有oligo（dT）i8和随机六聚体引物。
随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA
中任何RNA为模板合成cDNA°oligo（dT）i8选择性和RNA3'poly（A）配对结合，只以有poly（A）尾巴的mRNA为模板合成cDNA。
使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。
合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二犍cDNA的合成或线性RNA扩增，
也可用于需要用带有放射性或非放射性核昔酸标记第一徒cDNA的实脸，比如将标记好的第一徒cDNA作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
WORD版木
注意事项
避免核酸酶污染
RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。
RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛稳定地存在于实脸室中。
试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。
为防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。
避免RNA酶污染的常规建议：
•用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。
•整个实验过程戏手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。
并经常更换手套。
•使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水）
•使用RNA酶抑制剂5比如试剂盒中提供的FermentasRiboLock"RNA酶抑制剂来保护RNA。
•试剂盒如不使用，要严格密封保存。
在反转录过程中，所有管子要确保扣严。
模板RNA
通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。
纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一槌cDNA的合成反应。
可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇冲洗沉淀两次）。
如果要进行RT-PCR，模板RNA要确保没有DNA污染。
在进行cDNA合成前，模板RNA必须用无RNA酶的DNA酶I（#EN0521）处理去除掉痕量DNA。
实验过程要设置无RT对照反应，即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有RT-PCR成分（RT■■对照）。
去除RNA中基因组DNA的实验步骤：
1.将以下成分加入到一个无RNA酶的管子中：
RNA
10x反应缓冲液（含有MgCl2）
1（11
DNA酶I，无RNA酶（#EN0521）*
1“1（1U）
无核酸酶的高纯度水
加到10“1
*对于每1“gRNA，不要使用超过lu的DNA嗨1（不含RNA酶的）。
2.37°C孵育30分钟。
3.加入1“150niMEDTA>65°C孵育10分钟。
在含有二价阳离子
（1）而缺乏藜合剂的环境中，RNA
会水解。
或者可采用酚/氯仿试剂抽提的方法来替代加EDTA孵育这一步骤。
4.使用制备好的RNA为模板进行逆转录反应。
RNA样品品质在进行cDNA合成前，要先评估RNA的完整性。
最经常使用的方法是跑变性的琼脂糖凝胶，然后用
澳化乙锭（简称EB，以下同）染色。
如果来源于真核细胞的总RNA在跑完胶后可清晰看到18s和28srRNA
WORD版木的条带，可认为RNA是完整的。
28srRNA的条带亮度约为18srRNA的两倍。
任何拖尾条带都是mRNA降解的信号。
如果这种拖尾条带出现，需要重新提取总RNA样品。
为了进行RT-PCR，需要评价纯化的RNA（人类，小鼠或大鼠）的适用性。
常用方法是在RT-PCR中设置对照，此对照含有试剂盒中提供的模板RNA和对照用GAPDH引物。
GAPDH特异性引物与人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR扩增后得到496bp的产物。
RNA样品用量
•0.1ng-5“g的总RNA或者1ng-500ng的poly（A）mRNA作为模板合成第一链cDNA，此反应可作为两步法RT-PCR中的起始步骤。
•使用1“g分离纯化的mRNA作为模板合成的第一槌cDNA，可用于第二链合成或者后续克隆反应。
引物合成第一徒cDNA使用的引物可为oligo（dT）i8引物，随机六聚体引物或者基因特异性引物
中的任意
一种。
01igo（dT）i8引物针对具有3'poly（A）尾巴的真核mRNA。
随机六聚体引物适用于总RNA（rRNA
或
者niRNA）。
因此，相对01igo（dT）i8，使用随机六聚体引物会得到更复杂的第一链cDNA混合物，这样会降低后续PCR实脸的特异性和精确性。
但是随机引物在以下几种情况中是有优势的：
比如没有poly（A）尾巴的mRNA或者使用富含poly（A）结构的RNA为模板。
基因特异性引物用于从总RNA或者mRNA混合物中合成特异性的某条或者几条cDNA，这种特异引物需要使用者自己提供。
第一链cDNA合成过程第一链cDNA合成可进行单样本反应，可以使用不同的模板平行进行多样本反应。
因此，准备反应
混合物可毎种反应组分单独加入，也可使用mastermix（mastermix含有除去模板RNA的以外的其他反应组分）。
取决于RNA模板结构的情况，将变性和退火分开操作可能会提高RT-PCR的特异性和精确度。
下面图表描述的是第一链cDNA合成的主要步骤。
详细步骤请见第六页。
图表中描述了包括RNA变性步骤的单样本反应和使用不同模板的多样本反应流程。
与单样本反应相比，多样本反应采用相同的反应体系（20ul）和相同的试剂用量，但试剂的加入顺序有所不同（见下图）。
WORD版木
图表L合成cDNA的单样本反应和多样本反应的实验过程概述
WORD版木
在7（rc下孵育5分钟终止反
操作步骤
开始前请先阅读第3-5页的注意事项。
RT-PCR
I.第一链cDNA合成融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，
离心后置于冰上。
1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。
模板RNA
总RNA
或者poly（A）mRNA
或者特异性RNA
0.1ng・5“g
10pg-0.5“g
0.01pg-0.5“g
引物
oligo（dT）i8引物随机六聚体引物基因特异性引物
1“1
1“1
15-20pmol
无核酸酶的高纯水
到12“1
总体积
12^1
2•可选优化步骤。
如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀短暂离心，65T孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。
3.将下列组分按照顺序加入
5XReactionBuffer
RiboLock™RNA酶抑制剂（20u/“l）
10mMdNTPMix
4“1
1[i1
2zzl
RevertAid™M-MuLV逆转录酶（200u/“l）
1“1
总体积
20“1
4.轻轻混匀，离心。
5.如果使用oligo（dT）i8或者基因特异型引物，42°C孵育60分钟。
如果使用随机六聚体引物，25"C.先孵育5分钟，随后42°C孵育60分
钟。
注意：
高GC含量的模板反应温度可升高至45T-
6.70C加热5min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应或者在-20C保存少于一周的时间。
如想延长保存时间，建议使用-70C保存。
II.第一链cDNA的PCR扩增合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。
第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的
1/10。
通常50“1的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2“loTaqDNA聚合酶＞PCRMasterMix
WORD版木
（2X）或者PyroStart™FastPCRMasterMix（2X）可用于扩增小于3kb的片段。
DreamTaq™DNA聚合酶扩增至6kb长的片段。
对于20kb的长片段，建议使用LongPCREnzymeMix和HighFidelityPCREnzymeMix°
合成cDNA用于克隆
I.第一链cDNA合成融化后，将试剂盒中各组分混匀并短暂离心，
离心后置于冰上。
1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。
模板RNA
poly（A）mRNA或特异性RNA
1“g
0.5-1fig
引物
oligo（dT）i8引物或随机六聚体引物或基因特异性引物
1.a1
1“1
100pmol
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