白色链霉菌PL36菌株产聚赖氨酸发酵条件研究.docx

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白色链霉菌PL36菌株产聚赖氨酸发酵条件研究

2008届毕业生

毕业论文

题目:

白色链霉菌PL3-6菌株产聚赖氨酸发酵条件研究

院系名称：

生物工程专业班级：

生物工程0402班

学生姓名：

赵爱霞学号：

20044850427

指导教师：

惠明、田青教师职称：

副教授、助教

2008年06月01日

摘要

ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-Lysine）是由微生物发酵合成的一种由赖氨酸单体通过ε-酞胺键形成的多肤。

ε-PL具有优良的抑菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、热稳定性高等特点。

采用正交实验对筛选的一株白色链霉菌StreptomycesalbulusPL3-6发酵产ε-聚赖氨酸（ε-PL）的培养基成分进行了优化。

结果表明，该菌株产ε-PL的优化培养基为:

葡萄糖3.0g·L-1、酵母粉0.5g·L-1、（NH4）2SO41.2g·L-1、KH2PO40.20g·L-1、K2HPO40.12g·L-1、MgSO4·7H2O0.05g·L-1、FeSO4·7H2O0.003g·L-1、ZnSO4·7H2O0.008g·L-1。

在优化培养基下，ε-PL摇瓶产量达到4.05g·L-1，比优化前提高了25%。

采用D152弱酸性阳离子交换树脂（H型）对发酵法生产的ε-聚赖氨酸进行了分离提取。

参考文献设计了合理的工艺流程。

离心分离发酵（pH3.2），调节滤液的pH值到8.5，过滤除去沉淀。

滤液通过D152离子交换柱（H型），用水和0.2N醋酸洗涤，用0.1N的盐酸洗脱。

用1N的NaOH调节洗脱液的pH值到6.5，加入活性炭脱色后浓缩到小体积。

加入乙醇和乙醚的混合物（体积比2:

1）后，析出白色晶体。

关键词：

ε-聚赖氨酸白色链霉菌发酵条件提取离子交换

TitleThestudyonfermentconditionofStreptomyces

albulusPL3-6producedε-PL

Abstract

ε-Poly-L-Lysineiscomprisedoflysinelinkedbyamidebondthroughmicrobialfermentation.IthasexcellentantibacterialactivityagainstGram-positiveandGram-negativebacteria,yeastandsomekindsofviruses.Inadditionalε-Poly-L-Lysineissolubleandattractiveheatstable.ThefermentationmediumofStreptomycesalbulusproducingε-poly-L-Lysinewasoptimizedbyorthogonalexperiments.Theoptimalmediumconsistedof3.0g·L-1glucose,0.5g·L-1yeastextract,1.2g·L-1（NH4）2SO4，0.20g·L-1KH2PO4,0.12g·L-1K2HPO4,0.05g·L-1MgSO4·7H2O,0.003g·L-1FeSO4·7H2Oand0.008g·L-1ZnSO4·7H2O.Theyieldofε-PLreached4.05g·L-1withoptimalmedium,whichincreased25%comparedtoinitialmedium.

Theseparationandextractionofε-Poly-L-Lysinefromfermentationliquidbyusingweakacidanion-exchangeresinD152.Theculturebroth（pH3.2）wasfilteredandthefiltratewasadjustedtopH8.5.Then,theprecipitateformedwasremovedbyfiltration.Thefiltratewasappliedonacolumnofweakacidanion-exchangeresinD152（H+-from）andwashedwith0.2Naceticacidandwater,successively.Thesubstancewaselutedwith0.1Nhydrochloricacid.Theeluatewasneutralizedwith1Nsodiumhydroxideanddecolorizedwithactivecharcoal,andthenevaporatedtoasmallvolume.Thesubstancewasprecipitatedasawhitepowderbyadditionofanethanolandether（2:

1）mixture.

Keywords:

ε-Poly-L-Lysine;Streptomycesalbulus;fermentcondition;extractionionexchangeresins

目次

1引言………………………………………………………………………………1

1.1ε-聚赖氨酸…………………………………………………………………………………1

1.2物理和化学性质……………………………………………………………………………1

1.3聚赖氨酸的发酵生产………………………………………………………………………2

1.4研究价值……………………………………………………………………………………3

2材料与方法……………………………………………………………………………………5

2.1材料…………………………………………………………………………………………5

2.1.1菌种………………………………………………………………………………………5

2.1.2试剂………………………………………………………………………………………6

2.1.3相关溶液及其配制………………………………………………………………………6

2.1.4实验仪器…………………………………………………………………………………7

2.2方法……………………………………………………………………………………………7

2.2.1菌种的分离与纯化………………………………………………………………………7

2.2.2培养方法…………………………………………………………………………………8

2.2.3分析方法…………………………………………………………………………………8

2.2.4提取方法…………………………………………………………………………………9

2.2.5验证方法…………………………………………………………………………………9

3结果与讨论……………………………………………………………………………………10

3.1ε-PL标准曲线的绘制………………………………………………………………………10

3.2碳氮源优化实验……………………………………………………………………………10

3.3无机盐优化实验…………………………………………………………………………12

3.4ε-PL的提取…………………………………………………………………………………14

3.4.1发酵液的预处理…………………………………………………………………………14

3.4.2离子交换树脂的预处理…………………………………………………………………15

3.4.3离子交换提取……………………………………………………………………………16

3.4.4发酵液的紫外吸收波长的测定…………………………………………………………16

3.4.5ε-聚赖氨酸组成定性分析………………………………………………………………17

结论……………………………………………………………………………………18

致谢……………………………………………………………………………………19

参考文献……………………………………………………………………………20

1引言

随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，对食品品质提出了更高的要求，除了食品的营养、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所关注。

由于食品的特殊性，对其防腐保鲜一直是食品研究中的重要方面。

长期以来，由于受到经济环境和开发水平的制约，几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期。

化学防腐剂如果超剂量使用会产生累积毒素和致癌作用，存在局限性。

因此，安全、广谱、高效及经济实用的天然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。

微生物食品防腐剂是天然防腐剂中的一大类，其是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到有抑菌作用的物质，主要为多肤类物质。

目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素（Nisin）和纳他霉素（Natamycin）。

我国分别于1990年和1996年批准上述两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜。

另外，ε-聚赖氨酸也是一种抑菌效果明显的微生物食品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的研究才刚刚起步。

由于这三种微生物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景。

1．1ε-聚赖氨酸

1977年日本学者S.shima和H.sakai[1]从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。

这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过α-梭基和ε-氨基形成的酞胺键连接而成，故称为ε-多聚赖氨酸（ε-PL）。

实际上多聚赖氨酸的合成是早在1947年由K.L.Eprain首先完成的[2]但是化学法合成的聚赖氨酸为α型，其赖氨酸残基之间的酞胺键是由α-氨基和α-梭基缩合而成，研究也证明了α-PL比ε-聚赖氨酸抑菌活性差且有毒性，因此目前在国际市场上。

ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了α-多聚赖氨酸[3]。

1．2物理和化学性质

ε-聚赖氨酸是一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物多肽。

赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接[4]。

具有高抑菌活性ε-聚赖氨酸的分子量在3600～4300之间，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。

红外光谱分析表明:

ε-聚赖氨酸在1680～1640cm-1和1580～1520cm-1有强吸收峰[5]。

H-[NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-CO]n-OH

ε-聚赖氨酸结构式NH2

ε-聚赖氨酸带正电荷，可以和阴离子物质发生结合；没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解；易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙醋、乙醚等有机溶剂；能够承受一般食品加工过程中的热处理，热稳定性高，120℃加热10min仍具有抑菌活性[17]，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染；ε-聚赖氨酸经6NHCl酸解24h后，测其赖氨酸的旋光度为＋23.8°，表明每个残基上携带1molHCl和水[6]。

ε-PL