非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究毕业论文.docx

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非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究毕业论文

本科毕业论文

题目

非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究

姓名

学号

专业

动物科学

指导教师

职称

中国·武汉

摘要I

关键词I

AbstractI

KeywordsI

前言1

1材料与方法2

1.1材料2

1.1.1质粒和菌株2

1.1.2实验试剂2

1.1.3实验仪器2

1.1.4实验动物2

1.2疫苗准备和免疫方法2

1.2.1疫苗准备2

1.2.2免疫方法2

1.3血样制备3

1.4抗生长抑素抗体检测3

2结果与分析3

2.1非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较3

2.2不同剂量的PGS/2SS–asd质粒免疫各组育肥猪抗体水平4

3讨论4

3.1非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。

4

3.2免疫剂量对免疫效果的影响5

4小结5

参考文献6

致谢7

摘要

将90只60日龄育肥猪均分为6组，T1-T4组用非抗性筛选生长抑素基因疫苗pGS/2SS-asd免疫，剂量浓度分别是2×108CFU/mL，2×109CFU/mL，2×1010CFU/mL，2×1011CFU/mL；C1和C2组为对照组，分别免疫C500空菌和PBS。

整个试验共免疫三次，每次免疫间隔4周。

ELISA抗体检测结果显示：

试验组在免疫初期抗体水平高于对照组，但是免疫后期差异不明显，不同免疫剂量组之间的抗体水平差异不明显。

总之，用新型生长抑素基因疫苗免疫育肥猪在免疫初期可以检测到高水平的抗生长抑素抗体，推测出此DNA疫苗免疫大动物可以很好地促进动物的生长。

关键词

pGS/2SS-asd；生长抑素；减毒沙门氏菌；基因疫苗；育肥猪

Abstract

Atotalof90commercialpigsattheageof60daysweredividedinto6groups.AnimalsinGroupC2wereorallyadministeredwithPBSasablackcontrol,WhatwereadministeredGroupC1isC500-salmonella.GroupT1toGroupT4wereimmunizedwithpGS/2SS-asd,thedensityofdosofGroupT1is2×108CFU/mL,GroupT2is2×109CFU/mL，GroupT3is2×1010CFU/mLandGroupT4is2×1011CFU/mL；Threetimesimmunizing,theintervalofimmunizingtotiesquotiesis4weeks.TheresultsofELISAantibodydetectionshowthat:

ThetestGrouphaveahigherlevelofanitibotyintheinitialstageofimmunization.Butthedifferencewiththemwerenotobviouslyinthelaterstage.thedifferenceofthelevelofanitibodythatfromGroupT1toGroupT4isnotobviouslytoo.Inall,usethegenevaccineofpGS/2SS-asdcangethighabtibodyoftheSSfromtheanalyzeoftheELISAresults.ConcludethatthiskindofDNAvaccinecanacceleratethegrowthrateofthebiganimal.

Keywords

pGS/2SS-asd;somatostatin;attenuatedSalmonella;geneticvaccine;pig

前言

生长抑素（somatostatin，SS）是下丘脑释放的14肽激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别是对生长及免疫反应具有明显的影响[1]，应用生长抑素主动或被动免疫动物，所产生的抗体与SS结合，能阻断SS与受体作用；同时在肝脏的作用下，加速循环中SS的清除，从而促进GH等多种激素的释放，加快动物的生长[2-5]。

国外已报道应用SS抗血清被动免疫或化学合成SS制成免疫原主动免疫牛、绵羊等家畜，可以显著提高增重效果。

国内杜念兴等已完成了在大肠杆菌中表达的基因工程亚单位苗、痘苗病毒表达的活载体苗等SS基因工程苗的制备，其中由痘苗病毒表达的SS基因工程苗已开发成为激生I号、激生II号等商品化产品。

激生I号苗对肉猪、肉羊、肉牛均有一定的增重效应，可使肉猪增重提高5%-10%，饲料报酬提高5%-20%，肉羊平均体重提10%-12%。

[6-7]然而，以上合成肽及活载体苗都存在免疫持续时间短，生产成本高，基因工程表达产物纯化繁杂等不足，此外痘苗病毒还有可能产生毒力回升，造成极大的安全隐患。

由于生长抑素分子量小（1658kDa），免疫原性弱，生长抑素常规免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组以增强生长抑素的免疫原性。

近来，大量的研究证实乙肝表面抗原（HbsAg）S区的第112与l13氨基酸密码之间可以插入10-20个氨基酸残基的DNA片段，S区的3’末端也可以嵌合外源基因片段，都不影响多聚体颗粒的形成，并且能将外源抗原决定簇呈现在颗粒外表面[8-9]。

鉴于此，曹少先构建了双拷贝生长抑素DNA疫苗pcS/2SS，免疫后大鼠后，抗体阳性率达到60%[10]。

但是该表达载体都是以抗性基因作为选择压力的，虽然在体外的分子生物学研究中非常有用，但在人和动植物体内无法实现，而且含抗药基因的质粒是导致临床抗药菌株播散的主要原因之一；同时抗生素的使用是基因工程产品制备过程中造成潜在痕量过敏现象发生的重要来源。

染色体-质粒平衡致死系统的出现很好的解决了这个难题，它的宿主菌通常是一类染色体突变体，突变的基因是细菌的管家基因，因其编码的产物为细菌生长繁殖所必需，故该基因的缺陷必然导致细菌死亡，该缺陷型菌株表现为不能在基本培养基上生长[12-13]；当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式共同构成染色体-质粒平衡致死系统，含有互补质粒的缺陷菌可在基本培养基上生长[14]。

此时，互补质粒对其宿主菌的生长成为必需，一旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡，因此，凡是能在基本培养基上生长的缺陷菌株必定含有重组质粒。

鉴于此，本实验室将平衡致死体系引入生长抑素基因疫苗，构建了非抗性筛选的生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-asd，并转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500中。

本研究的目的就是将该新型疫苗免疫育肥猪，通过间接ELISA法检测抗生长抑素抗体，探讨其免疫效果[15]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株

缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500和pGS/2SS-asd质粒[11]均由实试验室保存。

pGS/2SS-asd质粒的构建图如下：

1.1.2实验试剂　

PBS溶菌液为pH7.4、10mmol/L的磷酸盐缓冲液，LB培养基为胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化钠组成的液体培养基，DAP（二氨基庚二酸）过滤除菌，包被缓冲液为pH9.6、50mmol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂牛奶溶液，PBS稀释液为pH7.2、10mmol/L的磷酸盐缓冲液，兔抗猪IgG-HRP，洗涤液为0.05%吐温-20水溶液，TMB显色液，2mol/L硫酸终止液。

1.1.3实验仪器

恒温水浴摇床；酶标仪；恒温培养箱；冷冻离心机；微量加样器。

1.1.4实验动物

60日龄育肥猪，选自武汉附近商品化猪场。

1.2疫苗准备和免疫方法

1.2.1疫苗准备

挑取PGS/2SS–asd和C500单菌落分别接种于液体LB培养基，37℃，200r/min振摇培养至OD600为0.3-0.4，4℃3000r/min离心10min，弃上清，用灭菌的PBS调整细菌浓度至2×1011CFU/mL，备用。

1.2.2免疫方法

　选60日龄育肥猪90只，均分为6组，每组15只。

第1组（T1）灌注PGS/2SS-asd菌液，浓度为2×108CFU/mL，第2组（T2）灌注PGS/2SS-asd菌液，浓度为2×109CFU/mL，第3组（T3）灌注PGS/2SS-asd菌液，浓度为2×1010CFU/mL，第4组（T4）灌注PGS/SS-asd菌液，浓度为2×1011CFU/mL，第5组（C1）灌注C500空菌组，第6组（C2）为空白对照组，灌注灭菌PBS溶液。

分别于免疫前12h和4h禁食、禁水，并在免疫前30min，预先灌注（5mL/只）7.5%的NaHCO3以中和胃酸，然后进行免疫，剂量为10ml/只。

初次免疫4周后以相同剂量、相同方法加强免疫一次，再次免疫4周后以相同剂量、相同方法再加强免疫一次。

1.3血样制备

每次免疫1周后对育肥猪进行颈静脉采血，血液收集后，室温静置3h，4℃冰箱过夜，然后3000r/min离心30min，分离血清，分装后置于－20℃冰箱备用[16]。

1.4抗生长抑素抗体检测

包被生长抑素抗原每孔100ng/100μL，4℃过夜，弃反应液，用PBST液洗3次；加封闭液100μL/孔，37℃反应1.5h，弃反应液，用PBST洗涤3次；1/25,1/50,1/100,1/200,1/400,1/800,1/1600的浓度梯度（用封闭液稀释）加待测血清100μL/孔，同时设对照孔（调零孔：

不加任何反应液；非特异性吸附孔：

用PBS缓冲液代替血清，37℃反应1h，弃反应液，洗涤3次；加兔抗猪IgG-HRP（1：

2000稀释），每孔100μL，37℃反应1h，弃反应液，洗涤3次；加底物液，每孔150μL，37℃反应25min；加2mol/L硫酸终止反应，每孔50μL；OD450读数。

2结果与分析

2.1非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较

通过间接ELISA法对各个试验组和对照组的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。

由图1可以看出：

初免后一周，试验组的抗体效价水平明显高于对照组，第二次免疫后，试验组的抗体效价水平下降，水平在C2对照组与C1对照组之间。

第三次免疫后，试验组的抗体效价水平继续下降，最终下降到与对照组几乎同一水平。

图1试验组与对照组抗SS抗体水平检测

说明：

T1-4为试验组分别免疫不同浓度的生长抑素（SS）基因融合真核表达质粒PGS/2SS–asd，C1,C2组为对照组，分别免疫C500空菌与PBS，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。

2.2不同剂量的PGS/2SS–asd质粒免疫各组育肥猪抗体水平

通过间接ELISA法对不同免疫剂量的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。

图2显示：

初次免疫一周后，T1组抗体效价最高，第二次加强免疫之后，T3和T4组的抗体效价有所提高，效价水平在T1,T2组之上。

在初次免疫一周至五周的这段时间里，T3,T4组的抗体效价表现出较明显的上升趋势，T1和T2组的抗体效价表现出下降的趋势，特别是