2015酶工程第5章-酶的非水相催化.ppt

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酶的非水相催化,Chapter5EnzymeMoleculesEnzymaticcatalysisinNon-aqueoussystem,酶只在水溶液中发挥活性有机溶剂是酶的变性剂,？

1966，Dostoli&Siegel,水/氯仿中脂肪酶催化N-乙酰-L-色氨酸酯化，两相体系达100%，但水中收率极低,1977，Klibanov,微水介质下酶促合成酯、肽、手性醇等；酶不仅在有机溶剂中保持稳定，且具有高催化转酯活性,1984，Klibanov&Zaks，Science，224:

1249,非水酶学non-aqueousenzymology,胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在有机溶剂中具有催化活性,非水酶学能做什么？

a.研究非水介质中的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学等；b.研究酶催化的介质，开发非水介质和新的酶促反应体系，发展出介质工程（mediumengineering）；c.拓宽酶催化反应的应用范围，使酶法合成与化学法合成相互补充。

非水相酶催化的优势,易于分离纯化，以及酶的回收与再利用；b.增加某些底物的溶解度，加速反应；c.改变反应平衡：

在有机介质中，由于水的含量极微，导致酶促水解反应逆向进行；例：

蛋白酶水相催化肽链水解，有机相中催化肽链合成d.改变或提高酶的选择性，减少副反应；例：

无水吡啶中枯草杆菌蛋白酶选择性酰化栗树精胺,栗树精胺,Contentsofchapter5,5.1、非水相酶催化的介质体系,5.2、有机介质中的酶催化,Go,Go,5.3、酶非水相催化的应用,Go,5.1非水相酶催化的介质体系,5.1.1有机溶剂介质体系（重点）5.1.2气相介质体系5.1.3超临界流体介质体系5.1.4离子液体介质体系,非水相酶催化的介质体系,5.1.1有机溶剂介质体系：

酶在含有一定量水的有机溶剂中进行催化反应的介质体系；底物、产物两者或其中之一为疏水性物质；酶在有机介质中能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，发挥其催化功能；酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。

有机溶剂介质体系类型：

（1）微水-有机溶剂单相体系

（2）水-有机溶剂单相体系（3）水-有机溶剂双相体系（4）正胶束体系（5）反胶束体系,不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。

它们都对催化反应有显著的影响。

微水-有机溶剂单相体系,又称微水介质体系、非极性有机溶剂-酶悬浮体系,有机溶剂（98%）：

烃、醚、芳香族、卤代烃水（2%）：

酶分子的结合水，维持酶催化活性酶：

悬浮状态；不溶的固相酶，结晶/冻干/沉淀状态；或吸附在固体载体表面特征：

酶稳定性好，分散性差，催化效率低适用于：

水解类酶，减少含水量利于合成反应,Enzyme+water,Organicsolvent,

（2）水-有机溶剂单相体系,又称与水溶性有机溶剂组成的均一体系,有机溶剂（1020%，有时5070%）：

强极性，DMSO、DMF、THF、二噁烷、丙酮和低级醇等水：

水与极性有机溶剂可混溶酶、底物、产物：

溶解于体系特征：

易传质、反应效率高，对酶毒性大，除枯草芽孢杆菌蛋白酶和某些脂肪酶适用于：

水中溶解度低，反应慢的亲脂性底物降低系统冰点，进行低温酶促反应,Enzyme,Water+Solvent,（3）水-有机溶剂双相体系又称与水不溶性有机溶剂组成的双相体系,Enzyme,Organicsolvent,Water,有机溶剂（1020%，有时5070%）：

低/非极性，酯、烷烃、醚、氯代烷等水：

水与非极性有机溶剂不混溶酶：

溶于水相底物、产物：

依据亲疏水性溶于相应相特征：

反应一般发生在水相或两相的界面上，需振荡和搅拌加快反应；酶不易失活；产物抑制效应降低。

适用于：

强疏水性底物（如甾体、酯类、烯烃类）生物转化,（5）反胶束体系有机溶剂为主体，表面活性剂极性端朝内，非极性端朝外，酶在反胶束内部主体，反应在胶束两相界面进行。

（4）正胶束体系水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在液相主体中，反应在胶束两相界面进行。

常用表面活性剂：

丁二酸2-乙基酯磺酸钠（ATO）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、卵磷脂和Tween。

常用有机溶剂：

正辛烷或异辛烷多数酶包埋在反胶束中，能保持高活性和稳定性，表现“超活性”，模拟体内环境，研究酶结构和动力学性质。

不同类型的酶在反胶束中的排布模型：

5.1.2气相介质体系：

某些酶在液相中受到一定限制，如酶和辅酶操作不稳定、底物和产物溶解性差、产物抑制，在气相中得以克服；适用于易于挥发底物或能转化为气体的物质的酶催化反应；气体密度低，易扩散，气相中酶催化作用与液相明显不同。

例：

Hwang等人研究醇氧化酶在气相中催化的反应,5.1.3超临界流体介质体系：

超临界流体（supercriticalfluid,SCF）是指温度和压力超过某物质临界点所形成的可压缩性高密度流体，介于气液之间，如CO2,SO2,C2H4，CO2最常用，廉价无毒。

具有高扩散系数、低黏度和低表面张力,使底物向酶的传质速度加快，提高反应速度;可以改变酶的特性，如底物专一性、区域选择性和对映体选择性，增强酶的稳定性。

例：

超临界CO2中南极假丝酵母脂肪酶催化葡萄糖酰化反应,补充：

最常见的是超临界二氧化碳，其临界温度为31.06，临界压力为7.38Mpa；超临界水的临界点为374，22Mpa；超临界甲醇为239，8.1MPa。

超临界二氧化碳可轻易穿过细菌的细胞壁，在其内部引起剧烈的氧化反应，杀死细菌。

可用于清洗各种精密仪器，亦可代替干洗所用的氯氟碳化合物，以及处理被污染的土壤。

5.1.4离子液体介质体系：

离子液体（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐类；,b.离子液体熔点低的原因：

其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致；,无机阴离子：

BF4-、PF6-、SbF6-、NO3-等有机阴离子：

CF3SO3-、（CF3SO3）2N-、ArSO3-、CF3CO2-等,咪唑类吡啶类季铵盐类季磷盐类,-阳离子：

有机杂环或铵盐、鏻盐,-阴离子：

c.挥发性低、稳定性好，不可燃，不氧化，低毒，环境友好的绿色溶剂；d.对无机/有机/高聚物的溶解性好，疏水、亲水性等溶剂特性可调节；e.酶在离子液体中具有良好稳定性、区域选择性、立体选择性、化学键选择性等特点。

离子液体介质中的酶催化反应实例,离子液体介质中的酶催化反应实例,脂肪酶催化1-苯乙醇（1-phenylethanol）外消旋体的拆分,ee（对映体过量,enantiomericexcess）表示一个对映体对另一个对映体的过量，通常用百分数表示。

ee=（R-S/R+S）*100%,在离子液体中获得的产物e.e.值高于在有机溶剂中的值，但产率偏低。

离子液体介质中的酶催化反应实例,脂肪酶催化1-苯乙醇（1-phenylethanol）外消旋体的拆分,离子液体介质中的酶催化期刊论文,离子液体介质中的酶催化期刊论文,5.2有机介质中的酶催化,酶在有机溶剂中的存在形式,固态酶：

以固体形式存在于有机相中，包括冷冻干燥的酶粉、固定化酶、结晶酶可溶解酶：

水溶性大分子共价修饰酶、非共价修饰的高分子/酶复合物、表面活性剂/酶复合物、微乳液中的酶,结构因素有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，至少酶活性部位与水溶液中的结构是相同的。

X-rayFT-IRESEMEPRNMR不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数量级，因此认为酶分子结构的动态变化很可能是主要因素。

为什么酶在有机介质中具有催化活力?

X射线晶体衍射结果证明，有机溶剂中酶的结构至少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构相同电子顺磁共振（EPR）研究表明，固定化乙醇脱氢酶在有机溶剂中保持其三维构象，酶在有机介质中维持其天然构象并非必须固定化固态15N-NMR技术探测到酶活性部位氢键网络的存在，说明酶活性部位（His残基）的微环境在水中与在有机溶剂中相同环境扫描电子显微镜（ESEM）直接观察不同环境下枯草溶菌素的微观形态，发现酶活性部位不与溶剂发生直接作用，不因溶剂的改变而发生明显变化,作用力因素酶分子“紧密”状态主要取决于蛋白质分子内氢键，而溶液中水分子与蛋白质分子间形成的氢键一定程度破坏蛋白质分子内氢键，蛋白结构变得松散，呈“开启”状态。

酶分子紧密和开启状态处于动态平衡，表现一定的柔性。

蛋白质分子内与分子间氢键的动态平衡Zaksetal,1988,5.2.1酶在有机介质中的催化特性5.2.2有机介质中酶催化反应的类型5.2.3水对酶催化反应的影响5.2.4有机溶剂对酶催化反应的影响5.2.5有机介质中酶催化反应的条件及其控制,有机介质中的酶催化,5.2.1酶在有机介质中的催化特性,底物特异性立体选择性区域选择性键选择性热稳定性pH特性,有机溶剂影响酶的表面结构、活性中心结合部位、底物的存在状态（亲水/疏水），从而影响酶催化特性。

有机相中酶能够催化新的反应，生成新产物,酶在有机介质中的催化特性底物特异性有机介质中的酶活性中心结合部位与底物的结合状态改变，致使酶的底物特异性改变。

解释：

疏水性的相对强弱,N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯,N-乙酰-L-丝氨酸乙酯,不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应,N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯,N-乙酰-L-丝氨酸乙酯,极性较弱,极性较强,酶在有机介质中的催化特性对映体选择性对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。

立体选择系数（KLD）Km米氏常数Kcat酶的转换数,立体选择系数越偏离1，酶催化的对映体选择性越强。

酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中对映体选择性较差（为什么？

）可能因底物的两种对映体与酶分子结合方式不同，把水分子从酶分子疏水结合位点置换出来的能力不同。

增加体系的水含量能提高酶的对映体选择性，而在疏水性溶剂中酶的立体选择性较差。

N-乙酰丙氨酸氯乙酯,酶在有机介质中的催化特性区域选择性区域选择性（regioselectivity），即酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应区域选择系数（Krs）,1,4-二丁酰基-2-辛基苯,丁醇,脂肪酶,酶在有机介质中的催化特性化学键选择性键选择性（chemoselectivity），即同个底物分子中有两种以上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先反应，在不需要基团保护的情况下对特定部位基团衍生化。

6-氨基-1-己醇,什么是键选择性？

（S）-N-（5-amino-1-hydroxypentyl）benzamide,假单胞菌脂肪酶催化的酰基化反应,不同有机介质中的键选择性,酶在有机介质中的催化特性热稳定性许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的好部分酶在有机介质中能耐受高热有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关解释Klibanov和Volkin认为，由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子（或含量极低），由水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。

表：

部分酶在有机介质与水溶液中半衰期比较,酶在有机介质中的催化特性pH特性“pH记忆”/“pH印迹”（pHimprinting）现象有机介质中，酶所处的pH环境与酶在冻干、溶剂沉淀或吸附到载体之前所用缓冲液的pH相同。

现象：

脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反应最适pH值接近于水溶液中的最适pH值。

原因当酶被转移到有机介质，原有解离状态不变，被保持在有机介质中。

“pH遗忘”（pHforgetting）现象有机相缓冲液（organicphasebuffer）疏水性酸+盐缓冲对疏水性碱+盐缓冲对用有机相缓冲液控制酶的解离状态，消除酶pH印记特性的影响，称为“pH遗忘”,5.2.2有机介质对酶催化反应的类型,合成反应转移反应醇解反应氨解反应异构化反应氧化还原反应裂合反应/加成反应,有机介质中酶催化反应的类型合成反应水解酶在有机介质中能催化水解的逆反应，即合成反应（Why?

）酯的合成：

脂肪酶/酯酶的有机相催化例如，假单孢菌脂肪酶催化的反应：

蛋白酶在有机相中催化多肽合成,有机介质中酶催化反应的类型转移反应酯交换反应（转酯反应）例如，猪胰脂肪酶对外消旋体的拆分：

有机介质中酶催化反应的类型醇解反应假单胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯化合物,有机介质中酶催化反应的类型氨解反应脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应,生成酰胺和醇环氧化合物的氨解,有机介质中酶催化反应的类型异构化反应D-ACL（D-3-amino-2-caprolactam）的异构化木糖异构酶催化的异构化反应,有机介质中酶催化反应的类型氧化还原反应单加氧反应双加氧反应,二甲基苯酚,二甲基二羟基苯,二羟基苯,己二烯二酸,脂肪烃CH键、C=C键氧化,脱氢酶催化的还原反应：

羰基的还原,有机介质中酶催化反应的类型裂合反应/加成反应羰基的加成与缩合反应,水对酶空间构象的影响酶持其完整的空间构象需要一层水化层，称为必需水。

不同酶与必需水结合紧密程度不同，必需水量不同。

每分子凝乳蛋白酶50分子水每分子多酚氧化酶350分子水必需水是维持酶分子间次级键（氢键、盐键）所必需的，是维持酶构象的“润滑剂”。

5.2.3水对酶催化反应的影响,b.水对酶催化反应速度的影响,最适水含量时，酶蛋白结构的动力学刚性和热力学稳定性之间平衡，酶活性最大。

酶含水量最适含水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活,最适含水量：

在酶催化反应速率达到最大时的水含量。

例：

溶菌酶酶粉在水合过程中酶活力与酶含水量之间的关系,三种酶在不同溶剂中水含量对酶活的影响,酵母醇氧化酶,水含量较低时（图中10%），酶活随含水量增加而升高。

马肝醇脱氢酶,蘑菇多酚氧化酶,c.水活度（wateractivity）为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用“水活度”描述有机介质中酶催化活力与水的关系。

水活度（Aw）：

体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比，近似等于体系中水的蒸气压与相同条件下纯水的蒸气压之比f一定条件下体系中水的逸度f0相同条件下纯水的逸度p一定条件下体系中水的蒸气压p0相同条件下纯水的蒸气压,最适含水量与溶剂极性成正比，而最佳水活度与溶剂极性大小无关，故采用水活度作参数更确切。

Aw值较小有机溶剂中键合到酶上的水量与在空气中键合到酶上的水量非常相似，表明有机溶剂没有直接影响水与酶紧密结合Aw值较大有机溶剂使酶结合的水量减少（溶剂与键合位点的水分子发生直接竞争）,各种酶因结构不同，维持酶活性构象的必需水也不同，大部分酶需较高的水活度才表现较好的活力。

非水介质中酶要表现出最大活力，不仅需要有适当的水活度，而且水的位置也要正确。

对枯草杆菌蛋白酶进行超声波处理，可使酶活显著提高，这可能是结合在酶蛋白中的水分子在超声场中重新排布造成的,在不同溶剂中研究酶动力学时为了避免水的影响，最好保持恒定的水活度。

获取恒定水活度的方式：

用一饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂向反应体系中直接加入一种水合盐向每一溶剂中加入不同量的水,水活度的控制：

向干燥的反应器中直接加入某种高水合盐可获得恒定的水活度原理高水合盐在初始阶段释放结合水到体系中，供给酶必需水，本身变为低水合盐反应后期，此低水合盐结合反应产生的水变为高水合盐，保持了体系的水活度例：

以正己烷为介质，脂肪酶催化丁酸丁酯合成反应中的盐对Na2SO410H2O/Na2SO4Na2HPO412H2O/Na2HPO47H2O,5.2.4有机介质对酶催化反应的影响,a.有机溶剂对酶结构和功能的影响,有机溶剂对酶分子表面结构的影响：

酶与有机溶剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。

例：

枯草杆菌蛋白酶在乙腈中，有12个乙腈分子结合到酶分子中，其中有4个是原来水分子结合的位点。

有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：

减少整个活性中心的数量，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂的疏水性强弱。

有机溶剂与底物竞争活性中心结合位点，降低活性中心极性，降低酶与底物结合能力。

从而影响酶催化活性。

例：

甲醇可进入辣根过氧化物酶的活性中心，与铁卟啉配位结合,b.有机溶剂对酶活性的影响,有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，夺取酶分子的结合水，影响水化层，降低酶活,甚至引起酶变性失活。

表征溶剂极性与酶活力的关系溶剂的疏水参数logP,P表示溶剂在正辛醇/水两相体系中分配系数溶剂的lgP值越大极性越小，lgP值越小，极性越大酶活力与lgP值之间的定量关系Laane实验lgP4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想2lgP4，酶活力中等,有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。

c.有机溶剂对底物和产物分配的影响,有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。

选择2lgP5的有机溶剂作为反应介质最适宜,酶的“必需水”层是底物、产物分布的中介,溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难进入“必需水”层溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在溶剂中溶解度太低,

（1）酶的选择依据酶活力高低反应速率和反应时间酶的稳定性可重复使用的次数酶催化的选择性产物中某种异构体的产率和纯度

（2）底物的选择和浓度控制底物的极性与溶解度底物专一性的变化底物的可接近程度底物在溶剂与“必需水”中的分配情况底物的抑制情况,5.2.5有机介质对酶催化反应的条件及其控制,（3）有机溶剂的选择i疏水性参数（lgP）溶剂极性应适中2lgP5ii与水混溶的有机介质含量,例：

在二氧六环/水体系中，辣根过氧化物酶（HRP）催化对苯基苯酚的聚合，二氧六环含量对聚合物相对分子质量的影响。

（4）含水量的控制最适水含量,在最适含水量时酶催化反应的速率最大。

最适含水量与溶剂极性相关，随极性增大而增大。

水含量对假单胞菌脂肪酶（PSL）催化酯合成速率的影响,最适水活度,达到最大反应速率时水活度变化不大，所以水活度能更确切地反映水的影响。

水活度一般在0.50.6范围内。

水活度对PSL催化酯合成速率的影响,（5）温度的控制有机介质中，最适温度变化？

提高温度升高，立体选择性变化？

（6）pH和离子强度的控制最适pH值酶在冷冻干燥过程中，pH状态发生变化冷冻干燥保护剂（蔗糖、甘露醇）在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施，可加有机相缓冲液调节反应时的pH值,降低,与水相中的接近,5.3酶非水相催化的应用,酶非水相催化的应用,手性技术领域手性药物拆分手性聚合物制备功能性聚合物制备可降解高分子光电功能材料其他应用食品添加剂生产甾体药物转化生物柴油的生产,-手性技术领域手性药物,手性药物两种对映体的药理作用,例1：

环氧丙醇衍生物的酶法拆分重要的C3手性合成中间体，用于合成-受体阻断剂类药物、HIV蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等采用猪胰脂肪酶（PPL）在有机溶剂中进行拆分,例2：

布洛芬（ibuprofen）的酶法拆分采用脂肪酶，在80%异辛烷与20%甲苯组成的混合溶剂中，可以得到较高e.e.值的（S）-布洛芬添加少量极性溶剂如DMF，e.e.值可提高至91%,手性技术领域手性聚合物制备手性聚合物，亦称“旋光性聚合物，其分子中存在构型或构象上的不对称结构，因此具有旋光性质。

聚合物旋光性的来源手性单体聚合得到：

如氨基酸蛋白质聚合物分子的手性构象：

如DNA双螺旋手性聚合物具有特殊的光、电、磁性等特征，可作为特殊的功能性材料使用采用脂肪酶可在有机介质中通过转酯化反应合成,肪酶催化3,4-环氧己二酸-2-三氯乙酯与1,4-丁二醇的缩聚反应,脂肪酶催化3-羟基戊二酸甲酯的缩聚相邻分子间发生酯交换,功能性聚合物制备可降解高分子可降解高分子是指在一定条件下，能被生物体侵蚀或代谢而降解的聚合物材料可降解高分子用途广泛,内酯的开环聚合,聚糖酯的合成,功能性聚合物制备光电功能材料辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP，EC1.11.1.7）是一种糖蛋白，在辣根中该酶的含量很高HRP以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物生成自由基，并引发自由基聚合,HRP在二氧六环与水混合的均一介质中，催化酚的聚合，合成酚树脂。

自由基聚合阶段,自由基链传递阶段,发光聚合物聚对苯基苯酚的合成,酶法合成的聚酚具有较高的三阶非线性光学系数X（3），是重要的非线性光学材料。

导电聚合物聚酚胺的合成酶法合成的聚酚胺类物质具有电子共轭结构，通过掺杂表现出一定的导电性HRP能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化氨基酚类物质的过氧化反应，并引发聚合,其他应用食品添加剂生产食品乳化剂甘油单酯的生产食用香料香兰素的合成,香兰酸,香兰素,甜味剂阿斯巴甜（AsPartame）的合成人造甜味剂，甜度是蔗糖的150200倍主要添加于饮料、维他命含片或口香糖，代替糖的使用；许多糖尿病患者、减肥人士都以阿斯巴甜做为糖的代用品由嗜热蛋白酶催化L-苯丙氨酸甲酯与L-天冬氨酸缩合产生,其他应用甾体药物转化甾体药物的一般结构,甾体药物在水中溶解度小，在水相中的转化率很低，采用有机相催化可以大大提高转化率例：

可的松（cortisone）转化为氢化可的松（hydrocortisone）11-羟化酶：

又称细胞色素P45011B1，催化甾体母核11位上的-羟基化反应,其他应用生物柴油生产柴油（diesel）：

石油提炼后的一种油质的产物，主要成分是含C10C22的脂肪烷烃烷、环烷烃或芳烃生物柴油（biodiesel）：

由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯生物柴油的生产即甘油酯的醇解反应，一般利用废弃的动、植物油生产生物柴油,其他应用生物柴油生产生物柴油的优点可使用于任何柴油机，热值高，燃点高，使用安全可生物降解，无毒，环境无害，从可再生资源中提取使用生物柴油可降90%空气毒性所有燃油中，生物柴油能量衡算最高：

生产生物柴油过程中，每消耗1单位矿物能量能获得3.2单位能量使用中存在的问题成本偏高，比普通柴油高出1530%燃烧残留物具有微酸性，且残留的甲醇与甘油对发动机寿命存在潜在影响,从生物质到生物柴油,生物柴油生产装备,美国生物柴油发展趋势,中国生物柴油国际控股有限公司http:

/生产基地1：

龙岩卓越新能源发展有限公司（2001年成立），主要从事生物柴油及附属产品的研发、生产与销售，2007年产能5万吨生产基地2：

厦门卓越生物质能源有限公司（2006年成立），中国生物柴油公司在厦门的生产、销售及储备基地，设计年产能10万吨，分两期实施，一期工程5万吨于2008年6月开始试生产,