Crispr Cas9挑选单克隆有限稀释法.docx

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EffortsMakeDifferences

GenlociBiotechnologiesInc.

有限稀释法筛选单克隆

简介：

有限稀释法筛选单克隆技术广泛用于杂交瘤和其它非贴壁细胞系的单克隆分离。

然而，在贴壁生长的细胞接种密度比较低或未知的情况下，它对贴壁生长的细胞单克隆分离也是非常有用的。

这种方法快速而简便，但是像大多数单克隆分离方法一样，不保证克隆是从一个细胞长起来的克隆。

所以，通常会建议再做第二次克隆来增加单克隆的可能性。

试剂材料：

非灭菌

1.电动移液器

2.废液缸

3.记号笔

4.200μL移液器

5.8通道多路200μL移液器

灭菌

1.细胞培养基一（适合单克隆生长的培养基，30ml）

2.细胞悬浮液（密度在5x104到lxl05个细胞/mL,200μL）

3.96孔细胞培养板

4.灭菌枪头

5.试剂分装盘

6.1,5和10ml移液管

步骤：

1.用分装托盘装大概12ml合适的培养基，然后使用8通道移液器向96孔板每孔中添加I00μL培养基，除了96孔板左边AI孔不加。

2.向Al孔中加入200μL细胞悬浮液，然后用单通道移液器快速地从Al孔中转移100μL至Bl孔中，轻轻吹打混匀，同时避免出现气泡。

使用相同的枪头重复1:

2稀释比例到此列最后一孔，最后一孔H1吸出100μL培养基，使其与其它孔保持相同体积。

说明：

添加1000个至2000个细胞至A1孔（5×104到细胞/mL）是一个很好的起始细胞浓度，如果是比较难以生长的细胞，可以增加此浓度。

3.用8通道移液器添加100rL培养基到第一列各孔（使得细胞和培养基的最终体积为200μL/孔）,然后用同样的枪头迅速从第一列（Al到Hl）孔中转移100μL到第二列（A2至H2）孔中，轻轻吹打混匀，避免气泡。

4.使用同样的枪头，重复步骤3中的1:

2稀释比例到最后一列，最后一列（A12到H12）每孔吸出100μL培养基，使得96孔板中所有的孔都是100μL细胞悬液。

5.向96孔板每孔加入100μL培养基，使得所有的孔中最终体积为200μL,然后将日期和细胞类型标记在96孔板上。

将微孔板放在5%二氧化碳培养箱中，37℃培养，确保不受干扰。

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说明：

向微孔中添加过滤后的培养基（细胞在此种培养基中生长）可以提高难以培养的细胞的存活率。

6.这些克隆在培养4-5天后可以用显微镜来检测，培养7-10天后可以进行评估，这取决于细胞的生长速度。

检查每一个孔并将只含有单个克隆的孔做好标记。

这些单克隆可以从微孔中传代至大的容器中培养。

通常可以将单克隆转移到12孔板或者24孔板的一个孔中继续培养。

说明：

不推荐直接将单克隆从96孔板的微孔中转移至T-25培养瓶培养。

主要原因是这种情况下细胞可能因为无法适应培养瓶中的大体积环境而导致无法生长。

在初次传代细胞时可以使用一些调整培养基来帮助细胞存活和生长。