DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-疑难解答-李熙灿-Xican-Li.doc

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DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验）：

疑难解答与实验指导

李熙灿（广州中医药大学中药学院,2019.7）

（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide（PTIO•）RadicalScavenging:

ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2017.65,6288-6297[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3’,8”-DimerizationEnhancestheAntioxidantCapacityofFlavonoids:

EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.[3]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical（DPPH•）ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2018.3,13081-13086.

第一部分疑难解答

问：

自由基清除实验为什么选择DPPH和ABTS?

答：

因为二者都简单易行，所以，一直沿用。

但是，如果结合PTIO自由基清除，则更合理。

问：

FRAP法与DPPH和ABTS的区别何在？

答：

FRAP是Ferricionreducingantioxidantpower之缩写。

该检测法是基于铁离子（Fe3+）还原为亚铁离子（Fe2+）的还原反应，而设计的。

所以，整个反应没有自由基参与。

FRAP只能反应电子转移能力，不能研究自由基清除的能力。

之所以会选用FRAP法，是因为电子转移是自由基清除的一个机制。

所以，FRAP法宜结合DPPH•自由基清除、ABTS+•自由基清除、PTIO•自由基清除才有意义。

如果某化合物，经能有效地清除DPPH•自由基、ABTS+•自由基和PTIO•自由基，表明该化合物具有自由基清除能力，或者说有抗氧化活性。

在此基础上，如果该化合物还能还原Fe3+成为Fe2+离子，说明该化合物的抗氧化活性可能通过电子转移实现。

无疑地，单独使用FRAP法，无法说明某化合物具有抗氧化活性。

问：

DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：

DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。

此法是根据DPPH自由基有单电子，在519nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。

当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。

问：

DPPH自由基被清除的机制是什么？

答：

DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT），简要过程如下：

问：

实验中的溶剂应该怎么确定？

答：

优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。

值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：

样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？

答：

不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。

由于1mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：

测量完成后怎么计算IC50？

答：

IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。

有两种计算方法。

第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。

将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。

第二，通过浓度曲线的图直接读出。

在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：

为什么要用Trolox作为阳性对照？

答：

维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。

不过，维生素E难溶于水，而且易变质。

为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：

6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。

Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。

亦称水溶性维生素E。

为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

当然，除了Trolox外，也可以选用其他化合物作为阳性对照，如BHA,儿茶素，谷胱甘肽GSH,维生素C，槲皮素，EGCG等。

问：

为什么会出现清除率为负值的情况？

答：

样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致A>A0,清除率为负。

问：

DPPH•清除率会大于100%吗？

答：

理论上讲，是不可能的。

如果出现这种情况，要检测实验本身有没问题。

问：

ABTS•+清除实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：

ABTS二铵盐,中文名：

2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐，它与过二硫酸钾（K2S2O4）反应，可以生成绿色的ABTS•+自由基。

该自由基在734nm有最大吸收，所以，通过检测734nm的吸光度，可以测定其浓度。

一个物质加入到ABTS•+自由基工作液后，如果734nm的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性，属于抗氧化剂。

该法称为ABTS自由基清除法，可以用评价植物（或中草药抽提物）、纯化合物的抗氧化能力。

问：

ABTS•+自由基被清除的机制是什么？

答：

由于ABTS•+自由基是一种带正电荷的自由基，因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子，故ABTS•+自由基被清除主要涉及到电子转移（ET）机制。

问：

ABTS•+自由基工作液如何配制？

答：

需要用ABTS二铵盐与过二硫酸钾反应12小时才能配制。

问：

DPPH和ABTS自由基清除率有什么不同？

答：

清除率的计算方法大体相同，只不过检测的波长不同，也就是所用的A值不同：

DPPH用A519nm值；ABTS用A734nm值。

这是因为二者的检测波长本来就不一样。

尽管这样，对于同样的样品、同样的浓度。

DPPH和ABTS自由基清除率，会不同。

这是因为，ABTS自由基比DPPH自由基更容易清除。

换言之，对于同一个样品而言，清除DPPH的IC50值会大于清除ABTS的IC50值。

本文1.8节有对比的实例。

问：

PTIO•清除实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：

PTIO溶解后为紫色溶液，当有抗氧化剂清除PTIO时，溶液的颜色会减淡，通过测量吸光度的改变可以测量物质的抗氧化性。

问：

PTIO被清除的机制是什么？

答：

PTIO自由基能够在不同pH的水缓冲溶液中稳定存在，当溶液pH＜5.0时，PTIO•清除主要涉及到电子转移（ET），当调节pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH值有关，也就是说与氢离子（质子）浓度有关，据此，可证明其涉及PT机制。

问：

PTIO为什么比DPPH自由基难清除？

答：

因为PTIO•比DPPH•自由基稳定。

所以，一般需要2小时才可以清除，当然，活性好的样品，很快也可以发生清除反应，并褪色。

为了较好的实验效果，可以考虑加热或延长反应时间。

第二部分相关知识

DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。

概述如下表：

DPPH•自由基

ABTS+•自由基

PTIO•自由基

结构式

简单表达式

DPPH·

ABTS·+

PTIO·

分子式与分子量

C18H12N5O6;M.W.394.3

C18H24N6O6S;M.W.548.68

C13H17N2O2;M.W.233.3

带电情况

中性自由基

阳离子自由基

中性自由基

种类

氮自由基

（成单电子在N原子上）

氮自由基

（成单电子在N原子上）

氧自由基

（成单电子在O原子上）

外观

紫黑色粉末

没有纯的ABTS·+

紫褐色粉末

溶解性与溶液颜色

溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）

溶液呈紫色，浓度越高，颜色越深

溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）、水以及水性的缓冲液

溶液呈墨绿色，浓度越高，颜色越深

溶于水以及水性的缓冲液

溶液呈蓝紫色，浓度越高，颜色越深

CAS号

1898-66-4

无

18390-00-6

工作液配制方法

将已购的DPPH自由基粉末，溶解即得其工作液

将已购的ABTS二铵盐[（NH4）2ABTS]与过二硫酸钾（K2S2O8）黑暗中反应12小时后，再稀释得其工作液。

将已购的PTIO自由基粉末，溶解即得其工作液

工作液外观

紫色

墨绿色

蓝紫色

工作液紫外光谱与最大吸收

（50μg/mL）

（0.07mM（NH4）2ABTS+0.03mMK2S2O8）

（50μg/mL）

检测波长

519nm

734nm

557nm（水溶液）

检测原理

当A519nm值减少，表明DPPH·被清除。

其清除机制主要是氢转移HAT（hydrogenatomtransfer）

当A734nm值减少，表明ABTS·+被清除。

其清除机制主要是电子转移ET（electrontransfer）

当A557减少，表明PTIO·被清除。

其清除机制主要是电子移ET（electrontransfer）加质子转移PT（protontransfer）

用途

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

通过调节缓冲液的pH值，可以检测其抗氧化机制。

优势

清除速度较快，约30分钟（室温下）。

清除速度较快，约6分钟（室温下）。

（1）水溶性好，与生物相关性强；

（2）是氧自由基，能更好地表往ROS清除水平；

（3）抗氧化机制明确：

pH值小于5.0时，为电子转移ET机制。

当调节pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH值有关，也就是说与氢离子（质子）浓度有关，据此，可证明其涉及PT机制。

局限性

（1）只能在有机溶剂（如甲醇、乙醇）中进行，不能在水溶液中进行；也不能在缓冲液中进行。

（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。

（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。

（1）不能在缓冲液中进行。

当然，可以在有机溶剂（如甲醇、乙醇）和水溶液中进行。

（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。

（3）配制工作液需要的时间长（约12小时）

（4）ABTS·+与（NH4）2ABTS、K2S2O8共存于溶液中，无法单独分离。

所以，会导致无法预期的干扰。

清除反应速度较慢，约2小时完成。

不过，如果出现这种情况，可以适当加热（如37℃、50℃），或延长反应时间。

所需仪器

可见分光光度计（常量，检测液约3mL）

酶标仪（微量，检测液约200μL）

可见分光光度计（常量，检测液约3mL）

酶标仪（微量，检测液约200μL）

可见分光光度计（常量，检测液约3mL）

酶标仪（微量，检测液约200μL）

第三部分DPPH•自由基清除实验指导[1]

3.1DPPH测试液的配置

取DPPH固体1mg溶于24mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

最好避光保存，5小时内用完。

取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。

若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。

3.2样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。

3.3预试

取DPPH溶液1.0mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。

加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到500μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500μL为该样品液的最大用量。

则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL。

A0值：

取DPPH溶液1.0mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。

A值：

取（500-x）μL有机溶剂到比色皿中，加样品液xμL（x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0mL，混合使反应液总体积为1.5mL。

测A值。

【如】某样品的用量梯度为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，则加样如下：

样品液

95乙醇（或无水乙醇）

DPPH测试液

总体积

0μL

100μL

500μL

400μL

1.0mL

1.0mL

1.5mL

1.5mL

200μL

300μL

1.0mL

1.5mL

300μL

200μL

1.0mL

1.5mL

400μL

100μL

1.0mL

1.5mL

500μL

0μL

1.0mL

1.5mL

3.4最终测量：

每测一个用量需要测三个平行数据。

3.5DPPH•清除率（抑制率）的计算

（A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。

）

3.6使用注意事项

3.6.1测量前，要先用空白溶剂调零。

3.6.2将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。

3.6.3每次使用前后要注意比色皿的清洁。

3.6.4如果在实验过程中出现A值大于A0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A值（A本）。

这个A本值可以通过，加样品但不加DPPH的方法测得。

此时的计算公式为：

3.7实例

漆黄素清除DPPH•自由基量效曲线图：

说明：

①绘图软件为MicrocalOrigin，导出格式为TIFF。

②BHA,Trolox二者均为阳性对照组；③漆黄素的结构式如下：

第四部分ABTS·+自由基清除实验指导[2]

4.1溶液配制

4.1.1ABTS二铵盐储备液（7.4mmol/L）：

取ABTS二铵盐3mg，加蒸馏水0.735mL。

（MW＝548.7）

4.1.2二硫酸钾（K2S2O8）储备液（2.6mmol/L）：

取K2S2O81mg，加蒸馏水1.43mL。

（MW＝270.32）

4.1.3取0.2mLABTS二铵盐储备液和0.2mLK2S2O8储备液混合，黑暗环境下室温放置12小时，用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS•+自由基工作液。

（注：

也可以用95乙醇或无水乙醇，但必须是原装分析纯试剂，回收或重蒸者均不可用。

）

4.2样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

4.3预试取ABTS•+自由基工作液0.8mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

如果反应缓慢，可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到100μL时，ABTS•+自由基工作液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。

则对于该样品而言，其用量梯度宜设为20μL、40μL、60μL、80μL、100μL。

A0值：

取ABTS•+自由基工作液800μL加入到比色皿中，加95乙醇（或无水乙醇）200μL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0宜在0.70±0.02）。

A值：

取（200-x）μL95乙醇（或无水乙醇）加入到96孔板中，加样品液xμL（x是根据2.3预试结果确定样品液的用量），再加ABTS•+自由基溶液800μL，混合使反应液总体积为1mL，测A值。

【如】某样品的用量梯度为20μL、44μL、60μL、80μL、100μL，则加样如下：

样品液

95乙醇（或无水乙醇）

ABTS•+自由基溶液

总体积

0μL

20μL

200μL

180μL

800μL

800μL

1000μL

1000μL

40μL

160μL

800μL

1000μL

60μL

140μL

800μL

1000μL

80μL

120μL

800μL

1000μL

100μL

100μL

800μL

1000μL

4.4最终测量

参照4.3节，每个浓度平行测三次。

4.5ABTS•+清除率（抑制率）的计算

（A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。

）

4.6实例

漆黄素清除ABTS•+量效曲线图：

（见1.8节）

第五部分PTIO•自由基清除实验指导[3]

3.1PTIO•测试液的配置

3.1.1取PTIO固体3mg溶于20mL蒸馏水用水（缓冲液）溶解PTIO时，检测波长为557nm。

也可以用甲醇、DMSO溶解，此时检测波长均为585nm。

中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀，得“PTIO测试液”。

（PTIOM.W.233.3）

3.1.2用空白溶剂调零后，取800μL“PTIO测试液”和200μL缓冲液或甲醇（与PTIO溶液中的溶剂保持一致）于比色皿中，在557nm处测A值，即得A0值。

A0在0.2-0.6之间。

3.2样品液的配置

样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解，配成1mg/ml浓度的溶液，可适当超声使之完全溶解。

如果溶解性差，浓度小于1mg/ml也可以。

3.3预试

3.3.1取“PTIO测试液”800μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，不能立即褪色时则37℃水浴2小时后再观察，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

3.3.2此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

（如，在预试过程中，发现加样到200μL时，PTIO溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。

则对于该样品而言，其用量梯度宜设为0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL）。

3.4A值测量

用移液枪取“PTIO测试液”800μL加入到比色皿中，加样品液xμL（x是根据3.3预试结果确定样品液的用量），再加（200-x）μL甲醇混合，37℃水浴（或烘箱）30分钟或更久后，测A557nm值。

【如】某样品的用量梯度为0μL（测出的A即A0值）、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，其加样表如下：

样品液

甲醇（或水）

PTIO测试液

总体积

0μL

200μL

800μL

1000μL

40μL

160μL

800μL

1000μL

80μL

120μL

800μL

1000μL

120μL

80μL

800μL

1000μL

160μL

40μL

800μL

1000μL

200μL

0μL

800μL

1000μL

3.5最终测量

参考3.4的操作，每测一个用量需要测3个平行数据。

3.6PTIO•清除率（抑制率）的计算

（A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值）。

3.7实例

E-白藜芦醇（E-resveratrol）和Z--白藜芦醇（Z-resveratrol）清除PTIO•自由基的浓度曲线图（Trolox为阳性对照组）.

参考文献

[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical（DPPH•）ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2018.3,13081-13086.

[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3’,8”-DimerizationEnhancestheAntioxidantCapacityofFlavonoids:

EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.

[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide（PTIO•）RadicalScavenging:

ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2017.65,6288-6297

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