临床化学的干扰试验EP7修改版.docx
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临床化学的干扰试验EP7修改版
临床化学的干扰试验（EP7-A）
NCCLS文件（2002年7月翻译）
摘要
NCCLSEP7-A文件使临床实验室方法的干扰特性评估方式的一直。
EP7-A叙述了厂商过筛可能的干扰物、确认干扰作用、和肯定病人样品中的干扰等的方法。
这个文件也叙述了临床实验室为了确认干扰结果、和研究因为未预期干扰物使结果离散的方法。
提供了详细的例子。
EP7-A也含有干扰实验概念的背景信息，分析物和预期干扰物实验推荐浓度表，以及数据收集和分析工作表。
前言
干扰物可以是临床检验的显著误差[1，2，3]。
常规使用内部质量控制监测精密度，和参考材料的比较确认准确度，但是实验室不能方便地检测干扰物引起的误差。
虽然不断改进方法的特异性是一个目标。
本文件让实验室和以医学需要来评估干扰物。
注意到严密评估方案和配合评价技术的灵活性间的平衡。
实验室和厂商需要理解一
些概念，进行必要的选择，并且一起实现改善病人结果的共同目标很清楚，证实某干扰的作用、确定它的原因、设计改进方法等都需要实验室和厂商的合作。
资料包括解释化学和统计的概念。
注意：
本文件注重分析过程的干扰。
不是因药物和它的代谢物引起的生理作用。
1引言
1.1目的
本文件用于以下2个目的：
1）支持厂商和方法的开发人员确定方法对干扰物敏感的做法通过科学的证实的实验设计、规定实验的相应物质和浓度、明确数据分析和解释的方法，这样得到有意义的结果给用户。
2）使实验室在研究因干扰造成结果离散时，进行系统的研究，明确数据收集和分析要求，鼓励实验室用户和厂商间的紧密合作，才能证实、揭示、最终消除新的干扰物。
1.2采用的用户
2范围
2.1分析方法
任何分析方法，定量或定性的，都会受干扰。
本文件适用各种方法和分析仪。
2.1.2干扰物
干扰物来自内源性和外源性：
●在病理条件下产生的代谢物，如：
糖尿病，多发性骨髓瘤，胆汁阻塞性肝炎，等。
●在病人治疗中引入的化合物，如：
药物，非肠道（注射）引入的营养物，血浆扩
充剂，抗凝剂，等。
●病人摄入的物质，如：
酒精，毒品，营养补充物，各种食物和饮料，等。
●在标本准备时外加的物质，如：
抗凝剂，防腐剂，稳定剂，等。
●标本本身的基体效应，如：
其化学和物理性质和理想的新鲜标本的差异。
2.2概念和科学原理
2.2.1干扰对不准确度的影响
不准确度（总分析误差）主要有3个因素：
不精密度、方法特定的偏倚、和样品特定的偏倚。
方法评价一般仅估计了前2个。
样品特定的偏倚（即干扰）常对个别特殊样品的问题处理，而不是作为方法的确认特性。
从方法评价的做法上，干扰引起的系统偏倚，具有系统和随即误差二者，这2种误差统计上都是不准确度（总分析误差）的组分。
●对某指定的病人群体，在标本中的干扰物平均浓度引起系统偏倚，包括在方法偏倚的估计中。
对于这个平均偏倚的各个离散，在和较好的方法作比较时，表现为总的随机误差。
对某些方法，随机干扰作用超出了作为随机误差主要来源的不精密度。
●对某个别病人，干扰物造成的偏倚，依赖于病人标本中干扰物的浓度。
偏倚岁干扰物浓度而异，如：
因清除或代谢。
当病人状况变化时，造成偏倚的改变也许会对病人有错误的解释。
2.2.2临床的关系
检验医学必须把干扰和临床观点相结合。
临床表现确定，分析结果的影响是否应看作干扰。
检测的分析物形式和它的浓度必须明确地确定。
一些分析方法的似是而非结果也许反映了真实的分析物浓度，但是没有临床意义。
例如，火焰光度法和间接离子选择性电极法能准确检测血浆中的钠，和脂肪浓度无关。
但是，如果脂肪浓度很高，这些方法将出现假性的低钠。
直接离子法在这种情况下能正确地报告正常钠，因为此时结果是血浆中水组分的钠活度。
所以，对样品中总钠的过分估计是临床的要求。
很重要的是在解释干扰实验结果前，首先确定临床关心的浓度。
2.2.3分析前的影响
在分析前，分析物或它的浓度出现了变化，称为“分析前影响”。
这些不是分析干扰。
分析方法在分析时检测样品中所有的分析物，不论它原先有多少。
常见的分析前影响有：
●体内药物的（生理）作用，如：
药物作用使循环激素浓度的变化；
●分析物因水解、氧化的化学变化；
●分析物的物理变化，如酶的失活；
●标本的蒸发或稀释；
●被外加分析物的污染（如静脉注射内的盐，血液标本长期不分离造成葡萄糖的损失，溶血使红细胞减少）。
2.2.4相对干扰
对控制品或基础混合血清检测的分析物具有的干扰，经计算是相对的。
有时候，控制品或混合血清中含有内在的干扰物，如：
在获得混合血清的病人群体某物质的平均浓度。
常见的是胆红素、蛋白、和脂肪。
有些方法校正或纠正了干扰物的平均浓度，所以对病人群体的干扰作用已经降至很小。
典型的方法包括标本的预处理、空白纠正、以血清为基础的校准品、和计算纠正。
但是当干扰物浓度大于或小于病人标本的平均浓度时，会出现误差。
例如，某药物检测受蛋白影响，约每10.0g/L蛋白的偏倚为0.05μmol/L。
由于血清中的平均蛋白浓度为70.0g/L，相对于无蛋白液的偏倚为0.35μmol/L。
如果某方法已经对平均偏倚纠正了，当各个标本的蛋白浓度和平均浓度70.0g/L有偏离，每相差10.0g/L使药物结果±0.05μmol/L。
蛋白浓度为75.0g/L的标本具有的偏倚为0.025μmol/L，不是0.40μmol/L。
除非标本蛋白浓度正好为70.0g/L，每个病人的药物结果都有小量的正或负偏倚，和实际蛋白浓度有关。
以下表归纳以上的例子。
假定药物浓度为25.0μmol/L，检测受蛋白的影响如上述。
注意：
作空白测定后引入的偏倚仅±0.20μmol/L，而不作空白测定的偏倚为＋0.15μmol/L到＋0.55μmol/L。
内在蛋白
浓度（g/L）
不作血清空白的测定
作血清空白的测定
结果（μmol/L）
偏倚（μmol/L）
结果（μmol/L）
偏倚（μmol/L）
30.0
25.15
0.15
24.80
-0.20
50.0
25.25
0.25
24.90
-0.10
70.0
25.35
0.35
25.00
0.00
90.0
25.45
0.45
25.10
0.10
110.0
25.55
0.55
25.20
0.20
2.2.5干扰的机制
干扰物对分析过程影响的方式有：
·化学作用。
干扰物和试剂竞争或抑制指示反应，干扰了结果。
也可以因为络合或沉淀改变了分析物形式，产生干扰。
·物理作用。
可能干扰物具有和分析物相似的性质，如能产生荧光、颜色、光散射、洗脱的位置、或电的相应等被检测和测量的信号。
·基体效应。
干扰物可能改变标本基体的物理性质，如粘度、表面张力、浊度或离子强度等，是检测的分析物浓度发生明显的变化。
·酶的抑制。
干扰物能通过抑制金属激活剂、和催化点的结合、或氧化必须的巯氢基等改变酶（分析物或试剂）活力。
干扰物也能竞争酶反应中底物，形成干扰。
例如，腺苷激酶会竞争和肌酸激酶（CK）反应的腺二磷（ADP），因此在某些CK测定方法中产生假阳性。
·非特异性。
干扰物会和分析物以同样方式参与反应。
虽然不同干扰物的非特异性有差异，但是它们在检验中的实际作用是一样的。
如：
在碱性苦味酸的肌酐方法中酮酸的干扰；在一些重氮胆红素方法中受吲哚硫酸盐的干扰等。
·交叉反应。
在免疫化学方法中，干扰物的结构相似于抗原，也能和抗体“交叉反应”。
这是一种非特异性。
例如：
在茶碱测定时咖啡因的干扰。
交叉反应的程度是免疫化学方法特异性的度量，但它不是对干扰敏感的估计。
·水取代作用。
非水物质（蛋白、脂肪）占据了血浆中水的体积，影响了活度的检测。
在报告血浆水中分析物浓度时，这些作用就不认为是干扰。
3．定义（略）
4．干扰试验的判断限（DecisionCriteria）
在进行评估实验前，为了确保实现目标，应该事先决定可接受限值。
评估者必须确定检验结果用于临床时，干扰对分析影响的大小，因为在设计干扰实验时取决于离散多大时被认为在临床上有意义。
在确定可接受规格时，要区分临床意义和统计意义。
二者均重要。
4.1临床可接受的限值
由干扰引起的允许误差的大小取决于检验结果的临床应用。
一些项目的准确度要求（总允许误差）已经有了建议；可参见文献。
有些项目的准确度限值用以下的方法确定。
可以将准确度（允许误差）分解为偏倚、不精密度、和干扰因素，从中建立允许的干扰限值。
在总允许误差中，除了方法偏倚和不精密度，以及分析物的生物变异外，余下的为干扰部分。
（视作各个变量）
4.1.1从生理变异考虑的限值
依据分析物的生理变异建立准确度要求的一种方法。
原则上，认为相对于分析物在个体或群体中固有的变异（取决于检验项目的临床应用）可以消除的分析变异量为误差限值。
这个方法对生理控制的分析物（项目）是合适的。
4.1.2从临床经验考虑的限值
常以临床专家的协调来建立准确度的要求。
依据他们的经验，参与者同意误差的限值，超过限值的误差将影响他们做出诊断或治疗的决定。
可以由相关学科的临床专家共同确定准确度和干扰限值。
4.1.3从分析变异考虑的限值
从检测方法的总长期不精密度也可以得到干扰的限值。
如果干扰作用相对于分析变异很小，如小于一个标准差；则由可能的干扰引起的误差增量不会影响临床的决定，该物质也不认为是一个干扰物。
这个方法的缺点是许多现代系统具有很好的精密度，则干扰的限值比医学的必要性更重要。
4.2统计意义（显著性）和作用
在确定某物质是否为干扰物前，评估者必须确认结果在统计上是有意义的。
要求作适当的重复，这样可以有充分的把握来检出临床上有意义的干扰，也可以有足够的可信水平肯定不存在临床上重要的偏倚。
见第6.1节依据检出可能性和可信限确定样品的大小。
本导则适用的统计方法称为“假设检验”。
评估者事先决定病人结果中多大的偏倚在临床是显著的。
这个允许偏倚量被认为是干扰限值。
检验的无效假设认为没有干扰（即：
偏倚不超过这个限值），另一种假设认为有干扰（即：
偏倚超过了限值）。
4.3实验的分析物浓度
应该在分析物的两个医学决定水平处进行初步的干扰评估。
如果费用或其他问题限制初步实验只能作一个浓度，要知道；有可能遗漏了其他浓度处临床上有意义的干扰。
附录A列出了许多常见项目推荐的实验浓度。
已经出版的临界或决定值被选用。
在缺少医学协调下的有些项目实验浓度是认为设定的。
绝大多数项目是按照临床应用选择参考范围的上下限和病理浓度。
4.4可能的干扰物
依据方法的特性，编辑了可能是干扰物的单子。
列出的物质存在于病人标本中，也考虑了方法的化学反应和它的应用。
以下列各点为导则。
●常见的标本不正常表现，如溶血、黄疸、和脂血。
●常用药物和非处方药。
●在病人群体中预期的不正常代谢物。
●检验项目涉及的病人群体常见处方药。
●药物包括其代谢物，因为它们的化学和物理性质可能会干扰检测方法。
●在相似方法报告有干扰的物质。
见Young等、Tryding和Roos等的文献。
●标本添加剂，如抗凝剂（肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐等），和防腐剂（NaF、碘乙酸、HCl等）。
●在收集和处理标本时接触的物质，如血清分离器用品、标本收集管和它的管塞，导管、导管的冲洗液、皮肤清洁剂、手洁净剂和洗液、玻璃清洗表面活性剂、涂粉的手套等。
●抑制影响某些检验的饮食（咖啡、β萝卜素、罂粟花籽等）。
涉及的物质很多。
属于下列的因为不是重要的干扰物，没有什么问题的可以不考虑：
·基本上和清单上列出的某物质具有相同的组成和结构。
·依据相同的科学原理，说明对方法没有干扰的物质。
·依据化学性质和方法的化学反应，不认为是干扰物。
·处方剂量的药物太少，不会引起干扰。
·药物清除或代谢很快，在分析时已经不具有干扰浓度。
4.5实验的干扰物浓度
要确定某物质是否在“最差”的条件下引起干扰，应该进行最高浓度的干扰过筛实验，这是实验室对要检验的标本进行观察的。
下面的导则有助于选择相应的实验浓度。
不同的机理会产生阳性或阴性的干扰作用（如血红蛋白既具有过氧化氢酶的活力，又在可见光范围内有强烈的光吸收），对每个物质在2个不同浓度实验，可以避免在实验浓度处对抗作用抵消的可能性。
见第6.3节的其他实验方法，可以同时在多个分析物和干扰物浓度下实验。
●药物和代谢物
血清、血浆和全血的标本，在报告的药物治疗剂量的2倍最高浓度下做实验。
如果预期的血浓度不知道，可以假定药物剂量被分布在5升体积，进行2倍于这个浓度的实验。
参见附录A-Ⅱ中常用药物推荐的实验浓度表。
作尿液检验时，确定在24小时排泄的最大量，2倍于该量进行实验（每升尿液的量）。
·内源性物质
同样，预先估计在病人群体中具有的最高浓度，并在此浓度下实验。
见附录A-Ⅰ推荐的一些常见的内源性组分实验浓度。
·抗凝剂和防腐剂
对于血清、血浆和全血，进行5倍添加浓度的实验，并应注意添加后立即实验“shortdraw”。
对于尿液，进行24小时尿液内每升含有的防腐剂量的5倍的实验。
·饮食物质
对于血清、血浆和全血，进行最大预期浓度的2倍的实验。
对于尿液，按24小时尿液中每升的排除量的5倍进行实验。
·标本收集和处理用品
将用品和标本接触24小时，使提取可能的干扰物。
使用的体积应视实际使用的最差状态。
防止标本的蒸发，使易挥发分析物的损失。
处理中应使用相应的控制标本以证实实验的标本，除了和用品接触外，其他的处理过程是相同的。
5质量保证和安全
在进行干扰试验前，确认：
●已经按照厂商的说明对仪器作了校准和保养。
●分析系统在控制中，按预期要求运行。
●所有操作人员接受了培训，具有可接受的熟练操作能力。
●符合实验室安全要求。
文件记录上述要求。
5.1训练和熟悉
进行评估的人员必须熟悉被评估仪器的操作，接受了培训。
按照仪器厂商的说明，
对仪器保养和维修完善。
5.2标准警示（略）
5.3精密度的确认
精密度必须和厂商的性能指标一致。
需要作可重现性（批内精密度）的估计，按第
6.1节实验要求确定重复次数。
如果不知道重现性资料，按NCCLS文件EP5进行初步评价。
5.4真实性确认
确定方法偏倚可以使用适当的回收实验或方法学比较实验（见NCCLS文件EP9）。
尽管恒定偏倚不影响干扰研究，但比例偏倚将会低估或高估干扰作用。
5.5交叉污染的估计
实验结果可能受处理标本时的交叉污染的影响。
如果存在交叉污染，应设计实验将交叉污染作用从干扰作用中区分开来。
5.6质量控制
实验开始前必须确认分析系统处在稳定运行中。
在实验中使用统计质量控制方法进行监视。
按照厂商要求或按NCCLS文件进行控制。
5.7安全和废弃实验用品
关于安全、处理实验室化学品的废弃，请参见厂商的标贴和有关规定。
6确定干扰性质
本节介绍评估某方法对干扰物敏感性的实验方法。
实验室希望按照这些方法去了解新方法整个性能的一部分，但是这些实验方法主要是让厂商用来确定他们方法的特性。
基本上有2个评价方法对干扰敏感的做法。
每个都有优点和不足，但是他们可以互相补充提供信息，所以应一起使用。
这2个方法是：
●将可能的干扰物加到有关标本中，观察干扰影响（见第6.1－6.3节）。
●将各个具有代表性的标本做评估方法和高度特异的比较方法的比较，评估偏倚（见第7.2节）。
6.1干扰过筛
将可能的干扰物加到混合标本中，和同一个混合标本作对照，评价相对偏倚，称为“配对差异检验”。
使可能的干扰物在较高的浓度下，形成“最差”浓度时评价干扰称为“干扰过筛”。
如没有观察到临床的显著意义，由加入物引起的偏倚就不重要，不必再做试验。
如果加入物具有临床显著意义，考虑为干扰物；应继续试验确定干扰物浓度和干扰程度的关系。
目前尚无实用的干扰评价试验的方案能确认所有干扰物。
一些干扰物（如药物的代谢物）在过筛中无法证实；而又会将一些物质误认为干扰物（如物质的形式不代表天然形式）。
但是干扰过筛提供了标准化评估，补充了真实病人标本的研究。
注意干扰试验的2个局限性
●加到混合血清中的化合物性质可能和体内循环的物质有差异。
●在检测的干扰物和分析物浓度时会抵消不同的干扰作用。
因此，一直观察几个胆红素浓度下血红蛋白具有的干扰作用（见第4.5节）。
将真正的病人标本的资料和“配制”标本资料结合起来有助于确定真实性。
6.1.1试验设计
在一批检测中，对实验和对照混合血清一起如病人标本那样同样检测，作适当的重复。
为了消除对没有干扰的无效假设出现假性拒绝（统计上为Ⅰ类错误）可能性，要求对样品作足够的重复检测，或对确实有干扰假设的假性拒绝（Ⅱ类错误）。
每个样品的重复次数取决于4个因素：
●具有临床显著意义的最小差异大小。
●检验的无效假设的可信限水平。
●检验确认假设的有效率。
●检测的可重现性（批内精密度）。
6.1.2试验材料
6.1.2.1基础混合标本
1）从数个没有服用药品的健康个体收集所需的新鲜标本（血清、尿液等）。
混合标本应
尽可能反映标本基体典型地符合检测的分析物的要求。
2）如无法收集合适新鲜标本，特别注意选择冰冻或冻干的标本。
处理过的控制品液体可能含有防腐剂和稳定剂，以及与实际不符的分析物结合状态，表现出的干扰作用和新鲜人血清不同。
评价者有责任确认，试验材料是否适合替代新鲜临床标本。
NCCLS文件可以参考。
3）考虑方法对样品量的要求，检测的物质数，和重复检测要求等，计算需要的混合材料的体积。
4）确定基础混合材料中的分析物浓度，加入合适的纯材料调节试验混合材料中的分析物达到医学决定水平。
避免引入其他物质。
请参见附录B推荐的分析物浓度。
6.1.2.2储存液
配制每个可能干扰物的储存液：
（1）获取合适的可能干扰物的纯品，或物质的最相似循环形式。
如果一定要使用药品级制品，注意药品内含有赋形剂、防腐剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗氧化剂、着色剂、调味剂、金属氧化物、抗衡离子、和填充剂等，其中任何一个材料也许是观察到的作用的真实原因。
（2）选择溶解试验材料的溶剂，具有最好的溶解作用。
参见手册。
要确认溶剂不会对评价方法具有干扰作用。
以下为常用的溶剂。
●试剂级水（参见NCCLS文件C3）；
●稀释HCl或NaOH；
●乙醇或甲醇；
●丙酮；
●二甲亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）；
●其他有机溶剂。
（3）对标本基体稀释越小越好，最好不超过5％。
因此加入的储存液浓度是要求浓度
的20倍以上。
（4）对有机溶剂要特别注意。
易挥发试剂应防止蒸发。
储存液应配制为可以达到的最
高浓度。
许多物质在水中的溶解度很差，可以加一些影响试剂或反应本身的后生物（artifacts）。
氯仿在血清中溶解度很低，至少作1：
100的稀释。
乙醇浓度超过1％～2％会使抗体失活。
注：
有时候，干扰会随着内源性物质〔如CO2、pH、或蛋白〕浓度的减少而增加。
为
了评价这种作用，应在对基体影响最小的情况下，使基础混合材料中的可能干扰物降低，又保持分析物的浓度。
用基础混合材料制备的对照控制，需要考虑稀释和添加的影响。
所用的方式取决于分析物和干扰物的性质，也必须由评价者认可。
6.1.2.3对照控制混合材料
应该和配制试验样品相同的方式配制对照控制。
加入和试验样品内加入干扰物相同体积的溶剂。
（1）如果在对照控制混合材料中含有试验的干扰物（如胆红素），用合适的方法确定内含浓度。
（2）若对照控制混合材料的检测分析物浓度和基础混合材料间的可比性差，应评估溶剂是否是可能的干扰物。
6.1.3重复检测次数
为了符合统计假设检验要求的可信限和可能性，需要确定重复检测次数。
●若假设没有强调干扰方向（阳性还是阴性），如在肌酐浓度为1.0mg/L时的偏倚为±0.2mg/L，应使用双侧检验。
●若在假设中包括了干扰的方向，如在肌酐浓度为1.0mg/L时，α-酮丁酸引起＋0.2mg/L的干扰，应使用单侧检验。
6.1.3.1双侧检验
用下列等式计算双侧检验需要的重复检测次数：
（1）
式中：
z1-α/2是双侧检验的可信限水平100（1－β）％的标准化正态分布的百分位数，z1-β是100（1－β）％可能性的标准化正态分布的百分位数。
s是检测批内重复的标准差，dmax是在某分析物浓度下最大的允许干扰。
6.1.3.2单侧检验
单侧检验只要将等式中的z1-α/2换成z1-α。
z1-α是单侧检验在可信限水平100（1－α）％时的标准化正态分布的百分位数。
（2）
6.1.3.3z百分位数值
为方便应用，将常用的z百分位数值列表如下。
表1.常用可信限水平和可能性的百分位数
百分位数
0.900
0.950
0.975
0.990
0.995
z百分位数值
1.282
1.645
1.960
2.326
2.576
例如，评价者需要检出±1.5mg/dl的影响，以此作为可接受干扰的程度，这是在95％的可信限（α＝0.05）和95％的可能性（β＝0.05）。
需要双侧检验。
可重现性（批内精密度）为1.0mg/dl。
计算需要的重复次数时，将这些值代入等式
（1）
=2[（1.960+1.645）1.0/1.5]2
=11.6
所以次数为12。
即每个样品（试验和对照）要求重复检测的次数。
6.1.3.4重复次数
在95％的可信限和可能性下检出各种干扰作用需要的重复次数见表2。
为方便应用，将干扰标准表示为批内重复标准差（dmax/s）的倍数。
表2在95％可信限和可能性下检出各种干扰作用需要的重复检测次数
dmax/s
重复次数（N）
dmax/s
重复次数（N）
0.8
41
1.5
12
1.0
26
1.6
10
1.1
22
1.8
8
1.2
18
2.0
7
1.3
16
2.5
5
1.4
14
3.0
3
6.1.3.5重复次数的影响
举例说明重复检测的适当次数的重要性。
医生将血清肌酐的少量变化视为肾功能损害（肾排斥）的指示。
有时候会对小于0.2mg/dl的变化很敏感。
但是实验室知道，有许多生物化学代谢物和药物干扰了碱性苦味酸肌酐测定方法，它们应对表现的损害（排斥）负责。
在某种情况下，近日肾可接受性为重复变化在1.0～1.2mg/dl间。
医生希望知道这个变化是否是头孢菌素引起的。
肌酐为1mg/dl时，批内的重复标准差为0.075mg/dl。
实验室考虑0.1mg/dl为显著的干扰。
如果进行适当的重复检测，可以将不精密度的影响减小到能检出0.1mg/dl的干扰影响。
首先，以批内重复性标准差（dmax/s）的倍数表示不精密度：
0.1mg/dl/0.075mg/dl＝1.33。
简略为1.3，从表2确定重复次数为16。
如果考虑较大的干扰，如有0.2mg/dl的影响也可接受，则dmax/s＝2.7，从表2可知，只要进行4次重复检测即可。
6.1.4试验方法
配对差异的干扰检验方案如下：
（1）确定相应的分析物浓度。
（2）建立“临床显著水平”的差异（dmax）标准。
（3）确定每批需要重复检测的次数（n）。
（4）制备临床标本的基础混合材料。
（5）制备试验用物质的储存液（20倍浓缩）。
（6）取1/20体积量的储存液加于容量瓶。
例如：
加0.5ml20倍浓缩储存液到10ml容量瓶。
（7）用基础混合材料补充至体积。
（8）取1/20体积量的配制储存液的溶剂加于第二个容量瓶。
（9）用基础混合材料补充
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