通过中药成分的肠内细菌生物转化和或代谢研究中药.docx
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通过中药成分的肠内细菌生物转化和或代谢研究中药
通过中药成分的肠内细菌生物转化和/或代谢研究中药
北京大学药学院·天然药物及仿生药物国家重点实验室
杨秀伟
一、肠内细菌与人和中药
自古以来，中医用药的特色之一是以汤剂的形式口服用药。
实际上，这种经口服用的传统汤剂（复方）在发挥药效作用之前，除了在炮制、煎煮过程中会产生动态变化而外，进入机体后亦要发生动态变化。
这种变化的第一个过程是在消化道内被消化液和人肠内细菌生物转化和/或代谢。
前者包括胃液、十二指肠液，等等。
后者包括构成人肠内微生态环境的细菌。
现代科学研究证明人和动物的肠内菌丛99％是厌氧性细菌，亚种和血清型水平以下的细菌达100种以上。
不同个体肠内菌丛构成不同，但总的趋势是类同的，同一个体相对稳定。
在人的胃内，链球菌和乳杆菌为优势菌群；在十二指肠，韦荣球菌、乳杆菌和链球菌为优势菌群；在回肠，韦荣球菌、乳杆菌、链球菌、双岐杆菌和消化链球菌为优势菌群；在盲肠和直肠，拟杆菌科细菌、链条杆菌、双岐杆菌和消化链球菌为优势菌群。
根据肠内细菌与宿主之间的关系，可将其分为共生性细菌和病原性细菌以及介于两者之间的细菌。
这些细菌产生各种各样的酶，可将诸如食物、食品、中药等中的化学物质转换为变异原性物质或致癌物质等，使药物失活。
同时，它们亦可使无活性型药物转换为活性型药物，即所谓“药物活化”，使有害物质无毒化。
在维持人体健康、增强机体免疫力、预防老年疾病等方面起着十分重要的作用。
已有研究证明：
以干粉形式吞服的中药，这些干粉细胞在消化液和肠内菌作用下破壁后向消化道释放出内含化学物质；而以汤剂形式口服的中药，化学物质直接进入消化道。
这些化学物质包括分子态或离子态、大分子或小分子、结合型或游离型。
由于中药基源复杂→成分复杂→性质复杂→作用复杂（多系统、多途径、多成分、多靶点→整体效应）→生物效应复杂；有肠内发生的，有体液和组织中发生的；有物理性相互作用，有化学性相互作用，更有生物性相互作用，因此，以化学物质为基础、以生物效应为现象，组成了庞大而复杂的体系。
这种庞大、复杂体系的“进口”是消化道。
外来异物性化学物质在消化道内的行为包括：
①以原形化合物形式吸收入血；②以消化道生物转化和/或代谢物形式吸收入血；③以原形或生物转化物和/或代谢物形式直接随粪便排出体外；④刺激消化道壁引发免疫激活产生生物效应；⑤一种外来化学物质促进另一种外来化学物质的吸收；⑥刺激肠内微生态引发生物活性物质分泌（如双岐杆菌因子）产生生物效应；⑦破坏肠内微生态平衡而促进新的平衡系统建立。
其中，肠内细菌对中药成分结构的生物转化和/或代谢在中药药效上有举足轻重的作用。
（一）、健康人肠内菌丛及其作用
一个人的肠内栖息约有100兆个细菌，构成了肠内菌丛。
健康人小肠菌丛细菌数目较少，且种类单一；盲肠内的细菌数增至1011/ml。
健康成人粪便内的最优势细菌有拟杆菌属（Bacteroides）、真杆菌属（Eubacterium）、消化球菌科（Peptococcaceae）、梭菌属（Clostridium）和双岐杆菌属（Bifidobacterium）等细菌。
肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和链球菌属（Strepto-ccoccus）细菌等亦常常检出，但其菌数不超过108。
健康人肠内菌丛是相当稳定的。
内、外因，如食饵急剧变化、感染、胃功能紊乱、肠蠕动紊乱、癌、外科手术、免疫功能低下、精神应激、抗菌素的使用、老化以及温度的急剧变化等原因都影响着肠内菌丛的平衡。
但其变动是非特异的，表现为小肠内细菌，特别是肠杆菌科和链球菌属细菌显著增加；大肠内双岐杆菌属细菌虽然减少或消失，但肠杆菌科和链球菌属细菌显著增加，产气荚膜梭菌亦常常增加。
肠内细菌具有在肠内进行各种各样生物转化和/或代谢的酶，借酶的作用可产生对宿主有用或有害的物质。
细菌毒素以及细菌细胞壁成分修饰着宿主的免疫功能；某些种肠内细菌起到防御对肠管有害细菌的增殖和感染的作用。
另一方面，自发性感染的病原菌，在宿主抵抗性减弱的时候发挥病原性作用。
因此，肠内菌丛影响着宿主健康和疾病，即营养、生理机能、药效、癌症、免疫反应、抗感染性、老化等等。
所谓肠内菌丛与宿主的健康和疾病的密切相关性，亦即肠内菌丛中有益菌对于宿主的健康长寿来说是相当重要的。
换言之，肠内有害菌成为优势菌会导致肝脏和肾脏功能的紊乱、动脉硬化、高血压、癌症、老化等各种疾病。
因此，通过摄取对于肠内细菌丛平衡有益的食饵、维生素Ｃ和E、食物纤维、发酵乳等促进有益菌的发育；或者摄取能够抑制肠内有害菌增殖的食饵等都能够达到维持宿主健康的目的。
随着基因重组技术的发展，如果能够培育出在肠内定植性和耐酸性都很强、且兼有能够将致癌物质无活性化的菌株，把其作为食饵来应用，或作为生菌剂来摄取，都能够改善肠内菌丛平衡以及肠内细菌的生物转化和/或代谢，这对于增强人体健康是十分有益的。
胃肠道（食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）和粪便中的细菌，随各部位结构不同，构成了不同的内生态环境，也导致了各部位的微生物种群和数量各不相同。
人消化道的细菌总数大约为1014/g，主要在结肠部分，约为1010～1011/g。
人胃肠道主要细菌数量及分布见表1。
表1人体胃肠道主要细菌数量及分布（Log/g）
菌群
胃
空肠
回肠
粪便
总菌数
肠杆菌
肠球菌
葡萄球菌
乳杆菌
酵母菌
拟杆菌
双歧杆菌
梭菌
优杆菌
0～3
0～2
0～3
0～2
0～3
0～2
少
少
少
少
0～5
0～3
0～4
0～3
0～4
0～2
0～2
0～3
少
少
3～7
2～6
2～6
2～5
2～5
2～3
3～7
3～5
2～4
少
10～12
4～10
5～10
4～7
6～10
2～6
10～12
8～12
6～11
9～12
食道由于所处位置原因——位于口腔和胃之间，导致了其上部的微生物与口腔接近，下部的与胃接近，其中的乳酸菌为过路菌。
在胃中，胃酸明显影响微生物的类型和数量，正常的胃液pH为3.0（2.2～4.4），来自食物和唾液里的大部分微生物被胃液中的盐酸杀死，仅剩下大约103/ml的细菌。
除胃酸以外，微生物还受到蠕动和抗体等影响。
在胃内容物中，可以分离到乳杆菌、链球菌、双岐杆菌、梭菌、韦荣菌、大肠杆菌、念珠菌和酵母菌等，但大多是过路菌。
乳杆菌和酵母菌数量较多，它们可能是土著菌，酵母菌在分泌区定植，乳酸菌在非分泌区定植。
一个人在餐后1~2小时，胃内的细菌从105/克内容物降至101~103/克内容物。
一般来说，即使胃内的生理状况有微小的变化，如pH升高，都可引起细菌数量增加。
细菌数量的增加可能会导致许多外源性异物在到达小肠之前即被生物转化。
与人和家兔相比，小鼠和大鼠胃内的主要菌群包括乳酸菌、拟杆菌和双岐杆菌，此可能与不同动物种属胃内pH不同有很大关系。
从十二指肠开始，细菌数目逐渐增加，但绝对数量仍然较少，占优势地位的是一些口腔革兰阳性球菌，一般只作短暂的定殖。
空肠中的总菌数从102到105/克内容物，其中乳酸菌（主要是乳杆菌和肠球菌）占总菌数（最高105/克内容物）的90%；此外还有草绿链球菌群（Viridianstreptococci）。
回肠下部菌群类似于结肠，细菌数达到106~109/克内容物，乳酸菌通常只有105/克内容物。
许多人的肠内菌丛失调与十二指肠和回肠的细菌分布变化相关。
以回盲瓣为界，以上的回肠内革兰阳性菌占优势，以下的结肠内革兰阴性厌氧杆菌占优势。
这种选择性可能反映了各部位抗细菌因素的不同；也可能随着从小肠过渡到大肠，微生物表面粘附因子与肠粘膜表面的互补作用发生了变化。
一旦穿越回盲“屏障”，盲肠和结肠中细菌数量发生了很大变化，高达1011/克内容物以上；种类也显著增加，超过60种。
但其中乳酸菌只有106～1010/克内容物。
这里厌氧菌较需氧菌占优势，数量比可达102～104/克内容物。
总之，从小肠开始细菌数逐渐增加。
小肠上部细菌数仍较少（1011～104/克内容物），主要是乳杆菌属、链球菌属和韦荣球菌属等细菌。
在回肠下部延至大肠总细菌数增加，其菌丛主要由构成大肠菌丛的肠杆菌科、真杆菌属、拟杆菌科、消化球菌科等细菌和小肠上部的菌丛构成。
以回盲瓣为界，大肠内的菌丛发生了显著变化，细菌数急剧增加，达到1011/克内容物以上。
拟杆菌科、真杆菌属、消化球菌科、梭菌属和双岐杆菌属等厌氧性细菌成为最优势菌群。
肠菌科、肠球菌、乳杆菌属、韦荣球菌属和葡萄球菌属等细菌达到105～107/克内容物，与粪便菌丛大体相同。
一般来说，粪便中的细菌量占粪便重量的1/3，每克干重含2×1011～4×1011个细菌，厌氧菌和需氧菌的数量之比为104:
1。
在不同人群中，粪便的菌群组成因饮食等生活习惯不同而差异较大；就某一个体而言，其组成是基本固定的，即使饮食有较大改变也只有微小的变化。
粪便中分离到的乳酸菌有104～109/g，其中的乳杆菌如嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌（L.salivarius）为常住菌，偶见的德氏乳杆菌乳酸亚种（L．delbrueckiisubsp.lactis）、干酪乳杆菌（L.casei）、植物乳杆菌（L．plantarum）、布氏乳杆菌（L．buchneri）是过路菌，不能在肠内定植。
粪便中的乳酸菌是一群重要的菌群，其中的双岐杆菌属（Bifidobacterium）细菌也是肠道正常菌群中很重要的成员，占健康儿童和成人总菌落的5%～10%。
小肠上部几乎检测不到双岐杆菌，而在小肠下部的数量可达103～106/克内容物。
盲肠中数量较少，粪便中可达108～1012/克内容物。
在人肠道中已知的双岐杆菌主要有5种：
两岐双岐杆菌（B．bifidum）、长双岐杆菌（B．longum）、婴儿双岐杆菌（B．infantis）、短双岐杆菌（B．breve）、青春双岐杆菌（B．adolescentis）。
此外，还有角双岐杆菌（B．angulatum）、小链双岐杆菌（B.catenula-tum）、假小链双岐杆菌（B．pseudocatenulatum）、伪长双岐杆菌（B．pseudolongum）、大双岐杆菌（B．magnum）、高卢双岐杆菌（B．gallicum）等。
（二）、从幼儿到成人肠内菌丛的变化
人们一直认为双岐杆菌是乳儿肠内最重要菌群。
离乳后，乳杆菌属细菌和大肠杆菌大大高于双岐杆菌。
现已明确，双岐杆菌是健康幼儿和成年人大肠内菌丛的主要菌群之一。
乳儿离乳后开始摄取食物，其肠内菌丛的革兰氏阴性杆菌优势模式与成年人的相近。
即粪便中总菌数的对数平均值为11.2/g内容物，双岐杆菌减少的数目大约是乳儿的1/10。
而拟杆菌科、真杆菌属、消化球菌科、梭菌属等的细菌凌驾于双岐杆菌属细菌之上。
（三）、老年人的肠内菌丛
随着老年期的到来，肠内菌丛开始发生变化。
总菌数稍稍减少，双岐杆菌减少，亦有完全检不出的个体。
与此相反，产气荚膜梭菌的检出率、菌数等显著增加。
乳杆菌属、肠杆菌科、链球菌属等细菌亦增加。
这种现象是由于宿主生理机能的衰老影响了肠内菌丛。
同时，伴随着肠内菌丛的变化，又进一步促进了宿主的衰老。
双岐杆菌占全菌丛的5～10%。
肠杆菌科、链球菌属减少至108/g内容物，乳杆菌、巨球形菌和韦荣球菌亦在成年人粪便中检出，菌数通常在107/g内容物以下。
此外，双岐杆菌菌种、菌型的模式，婴儿型:
主要由婴儿双岐杆菌（B.infantis）和短双岐杆菌（B.breve）构成；成年人型:
主要由长双岐杆菌（B.longum）和青春双岐杆菌（B.adolescentis）构成。
因此，基于中药的用药特点和人肠内细菌生物学特性，通过中药成分的肠内细菌生物转化和/或代谢研究中药将为中药的研究提供新的方法学。
二、肠内细菌转化和/或代谢中药的模型
（一）、人肠内主要菌群与模型制作
从人肠内菌丛中检出的菌群主要包括：
双岐杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属的链球菌等乳酸菌群，拟杆菌科（Bacteroidaceae）、真杆菌属、消化球菌科、韦荣球菌属（Veillonella）,巨球形菌属（Megasphaera）、吉米菌属（Gemmiger）、梭菌属、密螺旋体属（Treponema）等厌氧性菌群；肠杆菌科、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、棒杆菌属（Corynebacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、酵母等喜氧性菌群。
即肠内菌丛可大致区分为厌氧性菌群和好氧性菌群，如表2、3和4所示。
而且还可将这些菌群进一步分类为种（species）和生物变种（biovar）。
表2肠内主要菌群的区别
菌群
革兰氏染色
喜氧生长
孢子
主要发酵产物
乳酸菌群
乳杆菌Lactobacillus
+
+
-
乳酸
双岐杆菌Bifldobacterium
+
-
-
乙酸、乳酸
链球菌Streptococcus
+
+
-
乳酸
厌氧性菌群
拟杆菌科Bacteroidaceae
-
-
-
各种产物
厌氧性曲杆菌Anaerobiccurvedrods
-
-
-
丁二酸、丁酸
真杆菌Eubacterium
+
-
-
各种产物
消化球菌科Peptococcaceae
+
-
-
各种产物
韦荣球菌属Veillonella
-
-
-
乙酸、丙酸
巨球形菌属Megasphaera
-
-
-
己酸、丁酸
吉米菌属Gemmiger
-
-
-
梭菌Clostridium
+/-
-
+
各种产物
密螺旋体属Treponema
-
-
-
好氧性菌
肠杆菌科Enterobacteraceae
-
+
-
葡萄球菌属Staphylococus
+
+
-
杆菌属Bacillus
+
+
+
棒杆菌属Corynebacterium
+
+
-
假单胞菌属Pseudomonas
-
+
-
酵母Yeasts
+
+
-
表3不同年龄组人粪便中双岐杆菌的种和生物变种的发生频率
种的生物型
年龄组
婴儿
儿童
成人
老龄人
总样本数
52
28
42
18
两岐双岐杆菌（B.bifidum）a
b
2
10
11
7
1
3
1
婴儿双岐杆菌（B.infantis）婴儿型a
b
自由型
乳汁型
16
13
2
1
1
短双岐杆菌（B.breve）短型a
b
c
稍小型a
b
1
1
3
6
2
1
1
青春双岐杆菌（B.adolescentis）a
b
c
d
5
1
8
1
12
8
14
1
17
22
23
5
4
15
7
1
长双岐杆菌（B.longum）a
b
5
14
11
9
20
7
5
1
表4健康成年人和老年人的肠内菌丛
肠内菌丛
健康成年人（42）a）
健康老年人（54）
总数
11.20.2b）
11.10.2*
拟杆菌科Bacteroidaceae
10.90.2（100.0）c）
10.90.3（100.0）
真杆菌属Eubacterium
10.40.4（100.0）
10.10.7*（100.0）
消化球菌科Peptococaceae
10.20.3（100.0）
10.00.6（100.0）
双岐杆菌属Bifldobaoterium
10.00.8（100.0）
9.40.8***（85.2）
韦荣球菌属Veillonella
7.41.2（78.6）
5.22.0***（61.1）
巨球形菌属Megasphaera
9.00.5（33.3）
8.51.1（16.7）
曲杆菌Curvedrods
9.70.5（23.8）
9.30.9（29.6）
产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens
4.41.2（45.5）
6.62.0***（83.3）**
其他梭菌Clostridium-other
9.50.5（66.7）
9.60.8（100.0）**
乳杆菌属Lactobacillus
5.82.1（90.5）
7.51.7***（98.1）
肠杆菌科Enterobacteriaceae
7.80.8（100.0）
8.21.3（100.0）
Staptococcus
7.91.4（100.0）
7.41.6（100.0）
葡萄球菌属Staphylococcus
3.10.7（78.6）
3.81.2**（44.4）
棒杆菌属Corynedacterium
5.32.2（35.7）
4.72.0（7.4）
酵母Yeasts
3.91.6（42.9）
4.71.5（72.2）**
a）.引自Mitsuoka,T.etal.Zbl.Bakteriol.Hyg.,I.Abt.Orig.（1976）A234:
219-233；
b）.每克粪便细菌数的对数M±SD；
c）.*p0.05;**p0.01;***p0.001
肠内菌丛平衡的异常是非特异的。
如小肠内总菌数显著增加，特别是各种厌氧菌以及肠杆菌科或链球菌属细菌显著增加；大肠内双岐杆菌减少或消失，好氧菌,特别是肠杆菌科和链球菌属细菌显著增加。
在所有的肠内菌丛异常的情况下，产气荚膜梭菌均增加。
克雷伯菌属以及肠杆菌属细菌的增加也是肠内菌丛异常的原因之一。
如上所述生态学上的事实，说明在人的一生中，各年龄段的肠内细菌各有特点，可根据中医个体化治疗的特色选制不同的人肠内菌转化和/或代谢中药成分的模型。
（二）、实验动物肠内菌群与模型制作
实验动物与人的肠内菌群无论在数量上还是在质量上都有显著的差别，家兔盲肠和结肠缺乏乳酸菌，含有较少量的肠杆菌；大鼠和小鼠的肠内菌群与整个胃肠道的粘膜密切相关；人肠内菌群与大肠壁密切相关。
不同哺乳动物与人肠内及其粪便中主要细菌的比较如表5所示。
表5哺乳动物与人肠内和粪便中主要细菌的比较
细菌
人
大鼠
小鼠
仓鼠
家兔
豚鼠
总数
10~11.5
10~11
10~11
10
7~10
9~10
拟杆菌属
10~11
7~10
9~10
10
7~9
7~9
真杆菌属
10~11
9
9~11
（-）
6
8
双岐杆菌属
10~11
8~10
7
9
7~9
9
梭菌属
10
9~10
9~11
9
（-）
（-）
消化链球菌属
9~10
9~11
9
10
8
9
乳酸菌属
7~9
8~10
8~10
10
~3
8
链球菌属
4~9
8~10
6~8
5
2~4
3~7
肠杆菌属
4~8
5~7
4~6
6
~3
~6
丙酸杆菌属
9~10
ND
9
ND
ND
ND
梭状芽孢杆菌属
5~10
2~7
7~9
（-）
~3
~4
韦荣菌属
~6
4~10
~6
4
（-）
~4
葡萄球菌属
~8
~6
~5
5
~3
~7
每克样品中微生物数量log10值；ND：
未检测出（-）：
低于检测限
因此，可根据不同实验动物肠内菌特点选制不同肠内菌转化和/或代谢中药成分的模型。
（三）、肠液的中药成分生物转化模型
在厌氧环境条件下处理大鼠或小鼠，取出肠液，用厌氧稀释液稀释后在厌氧菌培养基内厌氧预温孵（37℃）培养30分钟（或根据实际需要而定）。
继续培养后，加入一定浓度的待研究转化中药成分，再在37℃温孵培养一定时间或定时取样分析。
此法适合研究肠内细菌的中药成分生物转化，适合大规模制备转化产物。
对于研究多细菌或混合细菌或肠内菌丛的中药转化尤为适合，在肠内细菌的中药成分生物转化和/或代谢研究工作中被广泛应用。
（四）、粪便培养基模型
首先把粪便灭菌、离心，取上清作为培养基，接种细菌。
应用此种方法，肠内菌丛在体外再现性良好。
但是，如果用同一培养基数回继代培养，肠内菌丛的再现性逐渐降低或失去。
用这个方法，把某人A的粪便与另外某人B，或不同证的C、D的粪便培养基混合培养，或是进行相反的组合，可研究不同粪便或不同证型肠内细菌对中药成分的生物转化和/或代谢。
（五）、人肠内菌丛体外（invitro）和体内（invivo）模型的建立
现已建立不受宿主影响、适合研究微生物相互作用、细菌对药物转化活性的厌氧性连续培养系统。
该系统的细菌菌丛在主要菌种、菌种多样性、细菌酶活性等方面与接种粪便菌丛类似。
把人粪便菌丛定植在无菌动物，然后在隔离器内饲育。
这个方法由于把细菌放置在与人肠道类似环境，所以，有益于对肠内菌丛化学物质毒性影响的研究。
该法选择的动物其肠道内含有的细菌酶类与人粪便酶类相似，对于食饵变化的菌丛应答也与人的应答类似。
这些体外和体内模型组合起来应用，有益于人肠道菌丛的总体转化活性以及对医药品、食品添加物、混入物质毒性的肠内菌丛作用的详细评价。
哺乳动物肠道内栖息的微生物菌丛受生物学因素以及生理化学因素影响，构成了高度复杂的生态系统。
肠内菌丛在免疫、生理、代谢、解剖学的构造、营养学、毒性学和多种反应以及机能方面与宿主具有相互关系，给宿主以影响。
为此，明确宿主与菌丛的相互关系和控制菌丛构成的机制是十分重要的。
此外，制造出与肠道内十分相似的环境（即模拟肠内环境）来研究肠内细菌菌丛对药物的转化活性也是我们期待的。
（六）、人结肠菌丛体外模型
这种类型的培养系统，可用于大鼠、小鼠、人等的大肠存在的细菌混合菌丛的体外维持。
菌体再循环过程由二阶段厌氧性连续培养系统组成（二阶段系统是在研究大鼠结肠菌丛过程中开发的）。
但在这种培养系统里，不能保持全部肠内菌。
为了创造与大鼠结肠酷似、细菌学意义上的菌丛能够在体外维持和有适宜的生长环境，连续相连的2个培养容器是必要的。
二阶段培养的两个容器的培养量分别为600ml、新鲜培养基（固体，梭菌属培养基，oxoid,U.K.）,、矿物类；氯高铁血红素-维生素K的稀释
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