Spred2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用.docx
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Spred2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用
Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用
大连医科大学
硕士学位论文
Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用
姓名：
曹晨
申请学位级别：
硕士
专业：
病理学与病理生理学
指导教师：
关宏伟
201106
Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用
硕士生姓名：
曹晨指导教师：
关宏伟教授专业名称：
病理学与病理生理学
摘要
引言：
T细胞在多种肝脏疾病的发病过程中具有重要作用，如病毒性肝炎，自身免疫性肝炎，酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病等，但是T细胞如何发挥作用及其相关细胞因子的信号调控机制仍不清楚。
其中急性乙肝病毒（HBV）的清除和肝细胞的损伤是两个不同过程，HBV清除在肝细胞损伤前就已经完成，当特异性杀伤性T细胞（CTL）的缺乏导致病毒复制不能得到有效控制时，可引起大量非特异性炎性细胞，特别是非特异性CD8+T细胞在多种细胞因子的趋化作用下对肝组织的广泛浸润，这是造成肝组织大面积损伤的基础。
为了深入研究T细胞应答在肝脏疾病中的作用机制，选择和应用与人类肝炎发病特征相类似的动物肝炎模型十分必要。
注射刀豆蛋白A（ConcanavalinA，ConA）诱发动物肝炎是一个已经建立完善的模型，这种模型的病理特征与人类病毒性肝炎，自身免疫性肝炎和药物性肝炎相似。
ConA诱导的肝炎主要通过快速活化多克隆T细胞包括为CD4+T细胞、CD8+T细胞和NKT细胞来实现自身免疫损伤。
其特征是血清谷丙转氨酶水平迅速升高，血清中含有大量细胞因子，肝脏出现白细胞浸润，肝细胞坏死和凋亡。
在这种由ConA诱导的免疫系统过度活化所引起的肝脏急性损伤模型中，T细胞的激活依赖于Thl细胞因子IFNy及其信号传导通路。
研究表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen—activatedproteinkinase，MAPK）信号传递途径在肝脏先天抗病毒防御系统、急性期反应、肝脏损伤与修复中均起着重要作用。
Spred（Sprouty相关的蛋白激酶异构体一1（EVH_1）domain）蛋白家族是一组与Sprouty相关的酪氨酸激酶结合蛋白，是重要的负调控因子，能够抑制生长因子诱导的胞外信号调节激酶（extracellularsigna卜regulatedkinase，ERK）的活化从而下调Ras—ERK一姒PK信号通路。
鉴于MAPK通路在肝脏生物学中的作用，由此推断Spred可能在T细胞介导的肝脏损伤中发挥重要作用。
通过Northern杂交检测小鼠各组织中的mRNA，发现Spred-2在全身各处均有表达，Spred一1仅分布于心、脑、肾、结肠等，而Spred一3特异地表达于脑组织中。
课题组之前利用DNA同源重组技术和胚胎干细胞（ES细胞）发育全能性的原理，
定点改变小鼠基因组的序列和结构，获得特定基因（基因组）即Spred-2被修饰的遗传性小鼠突变模型。
因此本课题将应用基因敲除技术构建的动物模型对Spred-2在T细胞介导的肝脏损伤的调控机制进行深入研究，为肝炎的治疗提供新的思路和启发。
目的：
探讨Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用。
方法：
雌性6’8周C57BL／6J（wT）小鼠和Spred一2基因敲除（Spred一2KO）
小鼠，单次静脉注射ConA（15mg／kg体重）后，6h、12h、24h麻醉后处死。
血浆液氮冻存，肝脏生理盐水冲洗后，一部分液氮冻存，一部分10％中性甲醛固定，另一部分0．25％胶原酶消化后分离肝脏白细胞。
生化法测定血清谷丙转氨酶浓度；试剂盒比色法测定caspase一3，8，9含量，ELISA法测定血清IFNY浓度；应用流式细胞仪测定肝脏T细胞和NKT细胞数目；RealtimePCR测定CXCL9／IO，CXCR3受体，Perforin，Fas，TNF—Q，IL-17mRNA水平。
结果：
ConA注射12小时后，Spred一2K0小鼠肝脏损伤较wT小鼠严重，血清谷丙转氨酶（7476．20±1387．54IU／Lvs．3752．63±803．36IU／L，P<0．05）
浓度升高；Caspase-3，-8，-9相对值为（63．78±11．90YS．17．35±4．48，P<0．05；48．21±7．62VS．8．89±1．92，P<0．05；48．07±7．39YS．8．23±2．36，P<0．05）
活性增加；血清IFNY（1．89±0．18ng／mlVS．0．81±0．22ng／m1，P<0．05）浓度升高，肝脏IFNY相对值（2．57±0．49VS．1．40±0．25，P<0．05）水平提高：
流式细胞术发现，Spred-2KO小鼠肝脏CDS+T细胞数量显著增加（8．41±2．13105／mlVS．5．15±1．18105／m1，P<0．05），CD4+T细胞和NKT细胞数量与WT小鼠无显著差异；CXCL9／IO，CXCR3受体，Perforin，Fas表达水平提高。
结论：
1、肝细胞损伤程度在具有Spred-2基因的野生型小鼠中较轻，肝细胞凋亡较少，提示Spred-2基因可能发挥肝细胞保护作用。
2、在小鼠急性肝炎过程中，包含Spred-2基因的野生型小鼠可能通过抑制Thl细胞的反应，降低炎症反应和趋化因子的水平来发挥肝细胞保护作用的。
3、Spred一2基因在ConA诱导的小鼠肝炎中的起到一定的保护作用，可能成为T细胞诱导肝脏损伤新的治疗靶点。
关键词：
Spred一2刀豆蛋白A肝炎CD8+T细胞
2
ProtectionofSpred—·2intheConA·-inducedLiverInjury
Masterdegreecandidate：
CaoChenSupervisor：
ProfessorGuanHongweiMajor：
PathologyandPathologicalphysiology
Abstract
Background：
Tcellsplaycentralrolesinthepathogenesisofliverdiseases，includingviralhepatitis，autoimmunehepatitis，alcoholicliverdiseaseandfattyliverdisease．AlthoughTcellresponseiscrucialintheliverpathology，theunderlyingregulatorymechanismbycytokinesignalingremainsunclear．TherearetwodifferentprocessesforacutehepatitisBvirus（HBV）clearanceandlivercelldamage，theclearanceofHBViscompletedbeforethelivercellinjury，andthelackofspecificCTLactivitycouldnotmakeHBVreplicationundercontrol，itcouldcausealargenumberofnonspecificinflammatorycells，particularlynon-specificCD8+Tcellschemotacticcytokinesundertheactionofalargeinvasion，whichcauseextensivedamageinlivertissue．Toaddressthis，studies嘶tllanimalmodelsofhepatitisalenecessary．ConcanavalinA（ConA）··inducedhepatitisisawell··establishedanimalmodelofhepatitisanditshistologicalfeaturesresemblethoseofviral-，autoimmune-or
druginducedhepatitisinhumans．ConA·inducedhepatitis，mainlythroughtherapid
activationofpolyclonalTcellswel"emainlyCD4+Tcells，CD8+TcellsandNKTcellstorealizetheirownimmuneinjury．Characterizedbytherapidserumalanineaminotransferaselevelsincreasedandserumcontainslargeamountsofcytokines，
leukocyteinfiltrationintheliver,livercellnecrosisandapoptosis．InthatConAinducedbytheexcessiveactivationoftheimmunesystemcausedbyacuteliverinjurymodel，AshepaticTcellsarerapidlyactivatedfollowingConAinjectionandmicelackingTcellswereresistanttothehepatotoxicity．ActivationofthecellsisdependentonThlcytokineIFManditssignalingpathway．
EvidenceindicatesthatMAPkinasecascadeplayscriticalrolesintheliverinnate
systemduringantiviraldefense，acutephaseresponse，hepaticinjuryandregeneration．Suppressorofcytokinesignaling（Spred）proteinsareintracellularinhibitorsofcytokinesignalingpathways，mainlyMAPkinasecascade．Spred—lSpred·2andSpred-3couldinhibitgrowthfactorinduced-ERKactivatedanddownregulateRas-ERKsingle，
3
ConsideringtheinvolvementofMAPKcascadeintheliverbiology,itisreasonabletospeculatethatSpredproteinsmayplayaroleinT-cell-mediatedliverinjury．Inthepresentstudy，wehavefocusedonSpred-2inTcellsandinvestigatedtheregulatorymechanismbehi
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