纳米材料介导微生物胞外电子传递过程的研究进展.docx

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纳米材料介导微生物胞外电子传递过程的研究进展

纳米材料介导微生物胞外电子传递过程的研究进展

摘要：

微生物胞外电子传递（EET）过程在自然界中普遍存在，并且在能源利用和环境修复等方面具有广阔的应用前景，但是低效的电子传递一直是其在实际应用中的关键瓶颈。

纳米材料具有独特的表面效应、体积效应、量子尺寸及宏观量子隧道效应等性质，引入纳米材料与电活性微生物相结合实现优势互补，可以缩短电荷转移路径，从而提高EET效率。

本文综述了EET方式，以及纳米材料的电子转移能力、氧化还原电势、表面结构与性质、生物相容性及纳米材料-微生物的界面构筑对EET过程的影响，重点阐述了纳米材料与电活性微生物界面构筑的各种策略，并讨论了这些策略的适用性和局限性，最后展望了纳米材料强化电活性微生物EET的未来研究方向。

关键词：

电活性微生物；胞外电子传递；纳米材料；界面；生物催化

引言

微生物胞外电子传递（extracellularelectrontransfer，EET）是电活性微生物通过特定的呼吸链将胞内氧化电子供体产生的电子转移到胞外电子受体，实现电子受体还原的同时维持微生物自身生长的过程[1-2]。

该现象于1987年由Lovley等[3]发现，此后EET受到了众多科研工作者的关注。

基于这种能力，EET在清洁电力生产、污水处理、生物修复、生物传感、高能燃料转化合成等方面具有重要的应用潜力和广阔的发展远景[4-5]。

然而，现阶段电活性微生物和电子受体之间相对低效的电子传递是影响EET在实际中应用的关键因素。

因此开发EET效率的改善手段，研究其传递机理、影响因素及应用前景研究具有重要现实意义。

目前，强化微生物EET的手段主要是通过内部遗传改造和外部纳米材料介导的两种途径[6-7]。

对电活性微生物进行遗传改造，主要是从以下两大方面：

一是直接增加电子传递相关的功能基因的表达；二是提高调节微生物胞外呼吸的蛋白活性。

然而，只有少数表征良好的电活性微生物可用于遗传改造，且EET的机制目前尚未完全阐明，导致大多数遗传工具无法广泛使用，限制了遗传改造技术的应用。

随着纳米技术的进步，在生物领域显示出了潜在的应用前景。

近年来，对纳米材料与微生物偶联作用的研究日趋活跃，尤其是纳米材料对EET的作用研究广受关注[8]。

纳米材料与电活性微生物主要存在电子转移和物理接触的联系，纳米材料介导EET的过程是决定其应用的关键，因此其作用机制研究是该领域亟需解决的关键科学问题之一。

本文将重点阐述纳米材料在EET过程中的作用，以及纳米材料-电活性微生物界面构筑的研究进展，并展望这个领域今后的发展趋势。

1电活性微生物的EET方式

目前，电活性微生物中已发现的电子传递方式主要分为两种：

（1）直接电子传递（directelectrontransfer，DET），通过胞外膜上的细胞色素c 或纳米导线将电子传递至胞外受体；

（2）间接电子传递（mediatedelectrontransfer，MET），通过电子穿梭体介导电子传递至胞外受体[9]。

这两种EET方式并非相互孤立的，一种微生物可能同时具有这两种EET模式。

已鉴定的两种电活性微生物，希瓦氏菌Shewanellaoneidensis MR-1（S.oneidensis）和硫还原地杆菌Geobactersulfurreducens（G.sulfurreducens），目前研究最为全面，它们已被用作了解其他物种同源系统的模式菌株[10-11]，其电子传递途径如图1所示。

1.1直接电子传递

图1 S.oneidensis和G.sulfurreducens胞外电子传递方式示意图[8-9,12]

Fig.1Extracellularelectrontransfermodelof S.oneidensis and G.sulfurreducens[8-9,12]

1.1.1细胞色素c 电活性微生物可以依靠细胞胞外膜上的细胞色素c 与胞外受体之间的直接物理接触来传递电子[13]。

S.oneidensis中的电子传递途径被研究者们称为Mtr途径（metalreductionpathway），代谢过程中产生的电子先被细胞膜内的细胞色素CymA接受，再通过c型色素蛋白Fcc3和STC跨过周质空间传递至MtrCAB复合体[14]。

然而，周质空间介导电子的细胞色素并不仅限于Fcc3和STC，Sturm等[12]证明同时敲除这两种细胞色素蛋白表达相关基因的突变株，在经过长时间的滞后期后仍能在柠檬酸中生长。

MtrCAB复合体负责希瓦氏菌的周质空间和外膜表面的电子连接，其中MtrA和MtrC分别从周质和细胞外侧锚定在MtrB形成的孔道内。

暴露于细胞外膜表面的MtrC和OmcA，作为呼吸链末端蛋白，实现胞外电子受体的还原[15]。

G.sulfurreducens 的EET模式与S.oneidensis 类似，位于内膜与细胞质相连的MacA可以接受醌池传递出的电子，并将其转移给周质中的三亚铁红素PpcA或PpcD，跨过周质空间后，再将电子传递给外膜蛋白OMCs（包括OmcB、OmcE、OmcS及OmcZ），最终传递至胞外的固体电子受体上，完成了电子的向外传递[16-17]。

1.1.2纳米导线微生物纳米导线（microbialnanowires）是从细胞表面延伸出长达数十微米的导电鞭毛[18]。

这种导电结构可以促进生物膜内微生物与固体电子受体的接触，也可以加强种间微生物电子传递。

不同种微生物之间潜在的电子传递机制存在差异。

研究发现，在S.oneidensis 中存在两种类型的纳米导线，一种是基于导电的Ⅵ型菌毛，被认为可以通过依赖芳香氨基酸间电子跃迁的方式传递电子[19]，另一种由El-Naggar等[20]最近发现S.oneidensis 外膜与周质空间可以向外延伸形成富含细胞色素c 的膜囊泡纳管，电子通过纳管上的细胞色素c以跃迁方式传递。

对于G.sulfurreducens，多数研究者也认为G.sulfurreducens可以表达多种纳米导线。

早期研究发现G.sulfurreducens鞭毛上有PliA蛋白，PliA蛋白羧基端芳香族氨基酸π-π轨道的重叠，使鞭毛具有与金属相似的导电性，从而引起电子传递[21]。

而最新的冷冻电镜结果表明，在G.sulfurreducens 的表面还存在OmcS纳米导线，OmcS纳米导线中的血红素分子连续排列，空间间距3.5～6Å（1Å=0.1nm），构成电子传递的通路。

Pirbadian等[22]研究发现，希瓦氏菌的纳米导线是其细胞膜的外突而非蛋白微丝，与地杆菌的纳米导线有本质区别。

Malvankar等[23]用静电力显微镜证实了G.sulfurreducens 的纳米导线连接着细菌，并实现细菌间的电子传递。

因此，这种优良的导电性和特殊的结构形态显示出纳米导线机制在促进远距离EET方面的潜力。

1.2间接电子传递

间接电子传递是基于电子穿梭分子在电子供体和受体之间的扩散[24-25]。

与整个细胞相比，这些分子具有更小的尺寸和更高的扩散，增强了它们与固体电子受体可用表面积的界面能力，从而大大提高EET效率。

研究发现微生物能自分泌到细胞外具有电子传递功能的穿梭体，如黄素类、吩嗪类等[26-27]。

Brutinel等[28]证实了S.oneidensis分泌黄素类物质作为电子穿梭体介导EET的可能机制，如图1所示，微生物在胞内分解有机物所产生的部分黄素腺嘌呤二核苷酸（flavinadeninedianucleotide，FAD）被转运至周质空间，然后在UshA（5'-核苷酸酶）的作用下水解为黄素单核苷酸（flavinmononucleotide，FMN）和腺苷一磷酸（adenosinemonophosphate，AMP）[29]。

FMN可以自由穿过外膜扩散至胞外，也或者进一步水解为核黄素（riboflavin，RF）。

胞外游离态的FMNox得到来自MtrC/OmcA的电子而被还原为FMNred，然后再通过扩散将电子传递至胞外电子受体紧接被氧化，以此方式来介导电活性微生物与胞外受体间的电子传递过程。

除了微生物自分泌的小分子，天然存在或人工合成的可溶性分子也具有传递电子的能力，如醌类、腐殖质等[30-31]。

另外，Okamoto等[32]研究发现S.oneidensis 分泌的黄素，除了以游离形式存在，还可以与外膜细胞色素形成细胞色素-半醌复合物进行电子传递。

这种复合物的氧化还原反应速率比游离形式的黄素快103～105倍。

但这种结合态会随着S.oneidensis 代谢的强弱而形成与消散，调控着EET的程度以及细胞内代谢活动。

对于这种结合形式，电子如何从复合物传递至电子受体，是继续穿梭？

还是直接接触电子受体表面传递？

以及这个过程对微生物的重要性如何？

目前还不清楚。

2纳米材料影响EET的主要因素

电活性微生物至胞外受体的电子转移能力是影响微生物EET体系效率的关键。

纳米科学的快速发展对微生物与胞外受体界面修饰从而促进EET提供了重要支撑。

已有研究表明，引入纳米材料可以降低电子从电活性微生物到胞外受体的界面阻力，增强电子从电活性微生物到胞外受体的转移，改善微生物的附着和生物膜的形成，并促进特定的代谢活性[33]。

纳米材料-电活性微生物界面电子传递过程受多种因素影响，如电子转移能力、氧化还原电势、表面结构与性质、生物相容性、界面相互作用、微生物种类、电子受体以及外界环境等。

这里主要综述了纳米材料的电子转移能力、氧化还原电势、表面结构与性质、生物相容性以及纳米材料-微生物界面构筑对EET过程的影响。

2.1纳米材料的电子转移能力

纳米材料能够介导电活性微生物EET与其自身电子转移能力（导电性、表面官能团等）密切相关[34]。

一般来说，纳米材料的导电性越高，越可以有效地接受电子并从微生物传递至终端受体。

碳基材料具有高的离域电子结构和载流子迁移率，并且碳基材料表面的氧化还原基团也具有辅助间接电子传递的效果[35]，因此常被应用于增强生物膜的导电性进而促进EET。

Liang等[36]考察了碳纳米管、活性炭和柔性石墨分别作为微生物燃料电池阳极对S.oneidensis MR-1产电性能影响，其中以碳纳米管作为阳极的MFC的功率密度最高，内阻最低，分别为402mW/m2和263Ω。

研究结果表明，相比于其他两种碳基材料，碳纳米管能够有效地降低MFC的阳极内阻和欧姆内阻。

循环伏安法分析表明，碳纳米管的介导使微生物EET动力学增强，包括S.oneidensis MR-1的外膜细胞色素OmcA的氧化还原活性提高。

除了利用纳米材料本身性质外，还可以通过引入表面缺陷和杂原子掺杂来调节纳米材料的表面电荷转移性质。

如You等[37]使用氮原子掺杂打破碳纳米管的化学惰性，在表面形成更多的缺陷，实验剖析证实多孔纳米碳材料表面基团与产电菌间的相互作用，有利于提高细菌胞外直接电子传递，进而改善MFC性能。

除了碳基纳米材料，研究人员也曾利用导电聚合物（如聚吡咯[38]、聚多巴胺[39]、聚乙烯二氧噻吩[40]等）介导EET过程，一方面降低了微生物至电极受体之间的传质内阻（Rct），以获得更高的MFC电流输出；另一方面同时改善了生物相容性，以达到MFC长期有效运行。

金属/金属氧化物具有更高的导电能力或易调控的氧化还原电势，也被引入介导EET过程。

为了单一评估电子转移能力对EET的影响，Li等[41]将Fe（Ⅲ）作为末端电子受体，不同醌类作为介导电子转移的氧化还原中间体，探究氧化还原中间体的电子转移能力与EET速率的相关性。

研究发现Fe（Ⅲ）还原速率与中间体的电子转移能力呈很好的线性正相关关系，相关系数高达0.933，表明纳米材料介导的微生物EET过程与纳米材料的电子转移能力密不可分；同时研究者发现将电极作为电子受体时，EET速率与电子转移能力的相关系数只有0.801，这表明了纳米材料的电子转移能力对EET的影响，不仅是纳米材料本身性质，也同时受其他因素影响，如电子受体等。

2.2纳米材料的氧化还原电势

电活性微生物通过内源或外源电子穿梭体促进EET，主要是因为这些穿梭体具有合适的氧化还原电势，能够接受细胞色素c的电子变成还原态，再将其传递至胞外受体随之被氧化。

纳米材料与微生物外膜、电子受体之间的电势差，决定着电子传递反应的驱动力。

Liu等[42] 研究发现在G.metallireducens 和G.sulfurreducens 共培养体系中，Anthraquinone-2,6-disulfonate（AQDS）能增强乙醇氧化和琥珀酸还原，但其无法介导G.metallireducens和Methanosarcinabarkeri互营促进甲烷产生过程，主要因素可能是氧化还原电势。

AQDS/AHQDS氧化还原电势为E0 =-184mV，可驱使延胡索酸的还原，而将CO2还原成CH4所需的电势为E0（CO2/CH4）=-240mV，高于AQDS/AHQDS氧化还原电势。

Li等[43]研究发现，将可溶的萘醌负载在氧化石墨烯上制备成固态的醌类化合物，能很好地促进微生物的铬还原能力。

因此，与可溶性穿梭体类似，具有合理氧化还原电势的固态纳米材料也可以作为氧化还原介体介导微生物的电子传递。

一般来说，微生物由呼吸作用获取的能力与纳米材料的中点氧化还原电势具有相关性[27]。

理论上，纳米材料的氧化还原电势应介于两个氧化还原的半反应之间[44]。

纳米材料的氧化还原电势不应低于终端电子受体的电势，否则纳米材料无法转移电子；同理，若氧化还原电势比电子受体高太多，则该反应无法顺利进行[44]。

Bian等[45]通过Sn掺杂In2O3纳米线（SINWs）调节其氧化还原电势到所需的范围，以降低细菌-电极界面的能垒，与未修饰纳米线的平面FTO电极相比，SINW修饰后可以使电流提高60倍。

微生物外膜的细胞色素氧化还原电势位于-0.2V，希瓦氏菌分泌的黄素氧化还原电势为-0.4V，合成Sn掺杂的In2O3纳米线的氧化还原电势位于-0.57V，在+0.2V的偏压下，细胞外膜传递的电子可以被黄素的氧化态接收，而合成的纳米线可以接受黄素还原态的电子并最后转移到电极上。

黄素/丙二酸的外源添加只增强/阻碍这一间接电子传递过程，也进一步证实了合成的纳米线可促进间接电子传递过程。

基于类似的策略，其他具有适当氧化还原电势的纳米材料，如α-Fe2O3、γ-Fe2O3和Fe3O4可以匹配细菌OMCs的能级并缩小电荷转移间隙，也被开发为可以有效介导EET的纳米材料[46-47]。

O'Loughlin[48]采用多种纳米材料介导S.putrefaciens CN32还原纤铁矿，研究显示纳米材料在表观电势为-254～+11mV条件下与Fe还原速率具有较好的相关性，其中r2高达0.973。

因此，热力学因素氧化还原电势不仅决定着纳米材料介导EET的顺利进行，还对纳米材料介导EET的速率具有很大影响。

表1总结了部分纳米材料的氧化还原电势和电子转移能力。

2.3纳米材料的表面结构与性质

纳米材料的微纳拓扑结构能有效直接影响微生物的黏附、增殖以及分化等生物学行为[52]。

比如纳米颗粒、纳米管、纳米线、纳米纤维和纳米片，不同的形貌会造成电子传导距离和接触活性位点面积的不同，因此会影响电子传递效率。

Xie等[53]使用溶剂诱导平面基底上的碳纳米管薄膜先溶胀后收缩，形成三维的褶皱结构，研究发现经处理后形成的拓扑结构会促进细胞和纳米材料之间的相互作用从而影响细胞功能。

起皱的碳纳米管膜利于微生物的附着、生长和电子转移，这种表面结构构建的阳极，使微生物燃料电池的输出电流提高了2.6倍。

三维的孔道结构无论是在化学催化领域还是生物催化领域，都是目前纳米材料结构设计的热点方向，主要是因为这种结构不仅允许微生物的内部定殖，还有利于底物和介质的畅通运输，保证了生物膜中细胞的高生存能力和高效的EET[54]。

另外，层级有序的三维连通孔道可提供多方向、高通量离子运输通道，有助于提升表/界面反应动力学。

Holder等[55]采用分凝成冰诱导的自组装技术制备了3D壳聚糖/真空剥离石墨烯复合材料并将其用于生物电化学系统。

证明了大孔和中微孔的协同作用，其中相互交联的大孔可以提供细菌进入材料内部和缓冲离子进而缩短扩散距离，薄壁上的中孔以及由于石墨烯堆垛而形成的微孔提高了接受电子的面积。

一些特殊巧妙的结构设计也被开发用于增强EET，如Wang等[50]使用电化学聚合法制备出了带有吸盘结构聚吡咯纳米线阵列，当其用于微生物燃料电池的阳极时，阵列上附着的细菌在新陈代谢过程会消耗阵列内管的氧气导致形成真空态，从而促使电极与细菌的强烈吸力，加快它们的相互作用，进而驱使微生物基于细胞色素c 的直接电子传递。

这种结构设计的微生物燃料电池功率密度高达728mW/m2，未来有望通过优化阵列的尺寸进一步提高电池性能。

表1纳米材料介导微生物EET

Table1Nanomaterialsmediatedmicrobialextracellularelectrontransfer

注：

E0为标准氧化还原电位；EAC为电子接受能力（electronacceptingcapacity）；Rct为传质内阻；Pmax为最大输出功率密度；AQC为蒽醌-2-羧酸（anthraquinone-2-carboxylicacid）；AQS为2-蒽醌磺酸（2-anthraquinonesulfonicacid）；AQDS为蒽醌-2，6-二磺酸二钠（anthraquinone-2，6-disulfonicaciddisodium）；2-HNQ为2-羟基-1，4-萘醌（2-hydroxy-1，4-naphthoquinone）。

纳米材料的表面性质（亲水性或者疏水性）也会对细胞行为产生影响。

Ding等[56]研究发现纳米材料表面的湿润性极大地影响了Shewanellaloihica PV-4的EET能力，该菌在亲水性的电子表面的EET能力比在疏水性表面高5倍。

研究表明，纳米材料表面的湿润性会影响胞外膜细胞色素的氧化还原态，胞外膜细胞色素为还原态时更利于外膜细胞色素与黄素结合，使胞内传递出来的电子能以黄素-细胞色素辅因子的形式进行传递，结合作用下EET效率比黄素单独作用快103～105倍。

2.4纳米材料的生物相容性

使用纳米材料与细菌结合，容易对细胞产生毒害作用，限制了微生物的催化效率。

纳米材料对细胞的毒害有直接物理破坏，或者产生活性氧自由基间接破坏[57]。

有研究报道石墨烯是一种具有良好生物相容性的碳基材料，但也有研究发现石墨烯具有一定的生物毒性，其尺状的边缘容易损害细胞膜，从而影响细胞的活性[58]。

Li等[43]将石墨烯与聚乙烯醇混合，通过真空抽滤制成薄膜用于铬还原，不仅增加生物相容性，而且制膜可循环利用，利于经济效益。

纳米材料的生物相容性并不绝对，与其形状大小、表面电荷、官能团及添加量密切相关[59]。

另外，研究也发现同一纳米材料作用于不同种微生物时会呈现出完全迥异的生物毒性。

除了降低纳米材料的生物毒性外，还可以开发具有保护细胞活性的纳米材料与结构设计。

Ji等[60]设计合成的MOF（metal-organicframework），能与Morellathermoacetica 表面的壁磷酸结合形成薄膜包覆结构，细胞表面的MOF可以催化降解氧应激产生的活性氧自由基，降低了这种厌氧微生物在有氧条件下的5倍死亡率。

半导体材料如CdS[61]、ZnS[62]、InP[63]等也被广泛用于微生物系统，它不仅可以利用半导体材料优异的光吸收性能，而且通过微生物和半导体的紧密接触可以降低电子转移的电阻，实现将太阳能高效转化为电能/化学能。

光激发下CdS空穴产生的活性氧物种（·OH、O2-·和H2O2）对细菌会产生一定的毒性并影响其生物活性，进而限制微生物的催化活性。

针对这一问题，Chen等[64]通过简单快速的方法在CdS表面修饰Mn3O4纳米酶，Mn3O4对CdS产生的活性氧物种有及时分解和物理分离的作用，原位修饰Mn3O4后·OH、O2-·和H2O2的浓度分别减少了90%、77.6%和26%，氮还原提高了28%，N2O的生成量减少了78%。

解决纳米材料与微生物作用的生物相容性问题，进而有效地增强微生物的催化活性。

2.5纳米材料-微生物界面构筑

除了考虑纳米材料本身的性质与结构外，纳米材料与微生物相互作用的界面也决定二者间的能量和电荷传递[65]。

总结以往的纳米材料与电活性微生物界面构筑的研究进展来看，从最早期研究者使用纳米材料对电子受体（如最常用的电极）进行修饰，电活性菌自然生长在纳米材料表面；到后面发展了一种新策略，纳米材料与微生物混合形成杂化的生物膜；为了更充分利用细菌胞外膜上的每一个活性位点，使用纳米材料原位修饰在细胞表面；紧接着，为了使纳米材料与微生物作用更紧密一步，将微小的纳米材料插入到细胞膜或周质空间，与细胞膜上的电子链的蛋白进一步作用；最后到近期，将超小的纳米材料引入到细胞内部，拓展了界面构筑的新思路。

纳米材料介导微生物胞外电子传递的过程，通常同时受多种因素影响，对于纳米材料的选取、构筑方式，一般都以研究目的或实际应用进行兼容考虑。

因此，接下来选取纳米材料-微生物界面构筑这个角度，阐述界面构筑对EET的增强机理以及优缺点，为具有类似功能的纳米材料提供构筑思路。

3纳米材料-电活性微生物界面构筑及胞外电子传递的研究进展

3.1电子受体表面修饰的电子传递

图2氧化石墨烯介导S.xiamenensis还原Cr（Ⅵ）的胞外电子传递路径图（a）[66]；IO-ITO|G.sulfurreducens电极组装成三电极体系,G.sulfurreducens置于硅片上的原子力显微镜图像,G.sulfurreducens在IO-ITO骨架上形成生物杂化电极的示意图（b）[69]

Fig.2Thepathwaydiagramofgrapheneoxidefilmsmediatesextracellularelectrontransferof S.xiamenensis toreduceCr（Ⅵ）（a）[66];AnIO-ITO|G.sulfurreducens electrodeisassembledintoathree-electrodesystem;Atomicforcemicroscopy（AFM）imageof G.sulfurreducens onasiliconwafer;Schematicrepresentationofabiohybridelectrodewhere G.sulfurreducens colonizedontheIO-ITOscaffold（b）[69]

自然条件下电活性微生物在固体胞外受体表面形成的生物膜薄且导电性差，为此很多研究团队开发了一系列的功能纳米材料以改善细菌和胞外受体的相互作用。

Li等[66]使用GO/PVA复合膜作为外源电子中介体，介导Shewanella EET用于Cr（Ⅵ）还原体系，使还原效率提高了3.13倍[图2（a）]。

研究发现，在还原过程中，GO/PVA膜不仅作为氧化还原中介体传递电子，GO/PVA膜的添加还会影响细胞的生理变化，提高电子传递链上的细胞色素c 相关基因表达量。

分别提高这些相关基因（mtrA、mtrB、mtrC、mtrD、mtrF 和omcA）的表达量后发现，基因表达水平的提升能显著促进Cr（Ⅵ）的还原速率。

Zhao等[67]通过在负载石墨烯的阳极表面修饰一层离子液体，带负电荷的阳极表面变为带正电荷。

由于静电作用，经离子液体修饰的电极可以紧密地吸引带负电的希