细胞培养常识.docx

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细胞培养常识

细胞培养

1.实验所需器材

1.1超净工作台

这是一般实验室可采用的普及型无菌操作装置，其工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效过滤装置净化后在通过工作台面，在工作台面构成无菌环境，超净工作台应放在清洁无尘的房间，普通超净台可作生物安全I一级安全柜使用。

1.2超净实验室

空气洁净度应达到104颗粒/m3以下，并且应具有紫外杀菌装置，无菌操作间的房顶、墙壁、地面均应光滑、无死角、并定期进行清洁、消毒、检测。

1.3细胞培养箱

一般情况下使用CO2培养箱，这种培养箱不但恒温，还可以控制CO2浓度（一般用5%），可以稳定培养液的pH，温度设置为37℃，且温度变化一般不超过0.5℃，体积通常在150-200L，相对湿度为100%，95%空气。

CO2培养箱是实验室必备的仪器，但因其中需放置盛水容器而湿度较高，从而导致霉斑（经培养鉴定为丝状真菌）快速生长而影响工作，有碍观瞻和可能导致试验样本污染或院内感染扩散,所以要定期对培养箱进行消毒，气套式的培养箱用75％酒精直接擦培养箱内壁即可。

1.4冰箱

细胞培养所用的各种液体均应低温保存，4℃冰箱用于存放培养、平衡盐溶液、消化液等即用液体，-20℃冰箱用来储存血清、胰蛋白酶、细胞培养所需添加的蛋白质性的生长因子等，因为这些液体需要冷冻以保持其生物活性,使用时可以放入4℃，避免反复冻融。

1.5细胞储存设备

成功培养的细胞在不用或保存时可储藏在液氮储存罐中，由于液氮会不断挥发，所以需要定期添加液氮，否则待液氮全部挥发，会导致细胞全部死亡，存放液氮储存罐的房间应注意通风，以防止液氮挥发造成操作人员的缺氧。

1.6液体除菌过滤装置

不能用高温高压灭菌的液体可以用微孔滤膜过滤除菌，实验室可选用1l或2L的不锈钢滤器，用橡胶气囊加压过滤，也可以用一次性针式滤器。

1.7高温高压消毒装置

细胞培养及其相关操作所用物品均需做无菌处理。

本实验室使用的为自备蒸汽式的消毒锅。

使用步骤：

1.准备：

首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

一般来说每次灭菌前都应该加水。

加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂。

加水最好加去离子水或蒸馏水，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。

2.放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。

将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。

以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。

然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间（在温度或者压力达到所需时，一般为121℃，20min,0.1MPa）需要切断电源），停止加热。

当温度下降时，再开启电源开始加热，使温度维持在恒定的范围之内。

因为温度太低达不到灭菌效果，太高可能会出危险。

5.灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，10分钟后取出灭菌物品。

如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的液体由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

注意事项：

1.灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。

2.降温时待温度自然降至100℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂

3.在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。

由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达121℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：

一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。

这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

1.8离心机

细胞培养过程中经常需要对细胞悬浮液进行离心处理，细胞悬浮液离心时的转速一般每分钟1000转左右，时间5-10min,离心前应注意样品配平，离心后待转速回零后在开启机盖取出样品。

使用步骤：

1.将盛有材料的离心管置于离心机金属管套内，必要时可于管底垫一层棉花，在天平上称过，调节管内材料的量，使相对两管连同其管套的重量相等。

如仅有材料一管，则可盛清水相对一管中以平衡。

2.将离心管及其套管按对称位置放入离心机移动盘中，将盖盖好。

3.打开电源，慢慢移动速度调节器的指针至所要求的速度刻度上，维持一定时间（大约5分钟）。

4.到达一定时间后，将速度调节器的指针慢慢转加零点。

然后关闭电门。

5.等移动盘自动停止转动后，方可将离心机盖揭开取出离心管，取出离心管时应小心，勿使已经沉淀的物质不因震动而上升，发生混浊。

6.使用离心机时，如发展离心机震动，且有杂音，则显示内部重量不平衡，若发现有金属音，则往往表示内部试管破裂，均应立即停止使 用，进行检查。

7.最后全面检查，切断电源。

维护与保养:

1.离心机应放在稳定的台面上，以防离心机滑动或振动，出现事故。

2.开动离心机时应逐渐加速，当发现声音不正常时，要停机检查，，排除故障（如离心管不对称、质量不等、离心机位置不水平或螺帽松动等）后再工作。

3.离心管要对称放置，如管为单数不对称时，应再加一空管放入相同质量的水，调整使其质量对称。

4.离心机的套管要保持清洁，套管底应垫上泡沫塑料等软料，以免离心管破碎。

1.9血细胞计数板

血细胞计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。

玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面，刻有一个方格网。

方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。

这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。

计数室通常有两种规格。

一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。

但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

2.0其他

建立实验室还需不同量程天平、磁力搅拌器等器材，另外，还需培养瓶、吸管、离心管、细胞冻存管、枪头青霉素瓶等用品。

2.细胞培养试剂器材处理

2.1培养液

直接无菌分装，取50mL的血清加入500mL的培养液中混匀后分装到250ml的瓶中，不要装满，分装后封口于4℃储存，以便使用。

2.2血清

使用时血清和培养液以混匀好。

如单独使用，直接无菌分装，-20℃保存，使用时37℃溶解，用无菌针吸取

2.3培养用品清洗

离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。

因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

2.3.1玻璃器皿的清洗

1.浸泡新的或用过的玻璃器皿都要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。

新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。

不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。

将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3.浸酸浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。

浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。

放取器皿要小心。

4.冲洗刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。

手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”10次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

2.3.2橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：

0.5mol/LNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/LHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

2.3.3塑料制品的清洗

塑料制品特点：

质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：

使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

2.4包装

对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。

常用的包装材料：

牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。

培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

2.5灭菌

高温湿热灭菌压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。

对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。

布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。

从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。

煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

一般高温湿热121℃,灭菌20-30分钟.

紫外线消毒紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。

革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。

紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。

直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。

因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。

离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。

灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。

紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。

实验进行前，细胞房及超净台台（laminarflow）以紫外灯照射30分钟灭菌；以75%乙醇擦拭超净台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟；实验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。

包括培养瓶、枪等。

实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作

小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。

容器打开后，瓶身倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶口朝上放置桌面，每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%乙醇擦拭无菌操作台面。

2.6细胞房的日常维护

无菌培养室每周都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次（拖布要专用），紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然后紫外线消毒30min。

—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

3.细胞培养所需液体的配制

3.1培养液

新购置的密封培养液在超净台内用75％酒精擦洗后，取50mL的血清加入500mL的培养液中混匀后分装到250ml的瓶中，无菌分装，不要装满，分装后封口于4℃储存，以便使用。

3.2胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：

D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1.称取胰蛋白酶：

按胰蛋白酶液质量浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，用磁力搅拌，速度要慢，不要起泡沫，溶解后，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：

配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用

3.3血清

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

血清的灭活是存在争议的问题，一般国产血清灭活，本实验中不采用灭活。

3.4PBS与MTT

PBS：

5mgPBS溶于2000mL的蒸馏水中，0.22μm滤器过滤密封以备使用

MTT:

用针管洗PBS，将一支MTT（250mg于黑管内）冲洗到100ml的干净玻璃瓶内，反复冲洗几次，使MTT完全冲洗出，总PBS用量50ml，浓度5mg/ml。

完成后加入磁子，盖上橡胶盖，用锡箔纸将玻璃瓶包裹好（MTT怕见光），搅拌使MTT溶解。

溶解后，在超净台内，用50ml注射器和无菌滤头（0.22μm）过滤除菌，分装到10ml的小瓶内，封口，锡箔纸包裹。

保存于4℃内。

3.5冻存液

　按照20%血清、10%的DMSO、70%的培养液的比例配制冻存液，放置于4℃内，备用。

3.6洗液

配置洗液：

称取20g重铬酸钾，加热使之溶解在40ml水中，然后缓慢倒入360ml工业浓硫酸并不停搅拌，配置好后装入有盖子的广口瓶中保存。

配制洗液的过程中，当倒入一定量（四五十毫升左右）的浓硫酸后，混合液便得很粘稠，象那种很稠的糨糊，继续倒入些浓硫酸后，则又变成液态混合液。

配置洗液的时候最好戴上口罩和塑料手套，因为浓硫酸和重铬酸钾都是危险的化学药品。

活化洗液：

新配置的洗液为红褐色，用久之后变成墨绿色，这是因为洗液中的Cr6+变成Cr3+的缘故，此时的洗液便失去氧化能力，不能再继续使用。

用高锰酸钾可以使失效的洗液恢复原来的效力，加热失效的洗液，慢慢加入研碎的高锰酸钾，直至颜色变成橙黄色为止。

静置除去沉淀，便可以接着使用，其效率接近原来的洗液。

注意事项：

最初加硫酸的时候千万不能加得太快，否则重铬酸钾会全部粘在一块儿，就失效了，而且在夏天配时要注意散热的问题，初加硫酸时会有热气产生。

另需要注意，器皿再用洗液清洗之前，应尽量洗净有机物，因为少量的有机物可使大量的洗液变绿。

盛洗液的容器应该加盖，避免硫酸吸水而减弱洗涤能力。

3.7新洁尔灭配制

取新洁尔灭倒入20L的桶内，按标签稀释倍数，加入蒸馏水稀释，混匀。

3.8消毒液配制

消毒液用于玻璃瓶和手的擦拭消毒，为75%乙醇和新洁尔灭稀释液的混合液，比例大致为3:

1

4.细胞培养基本操作

4.1无菌操作

培养所用的一切物品、液体均应无菌，操作前最好列出所需用品，培养液、消化液等需要37℃预热，所有物品准备好后在开始操作，避免往返拿取用品，无菌间或超净台的操作区域使用前后应用紫外照射30-60min,所有进入操作区域的物品需经75%的乙醇和新洁尔灭消毒，特别是有液体溢出时需要立即擦拭。

进入无菌间需要更换专用无菌衣，戴口罩和帽子，双手最好戴乳胶手套，然后用75%的乙醇和新洁尔灭消毒，在开放式工作台上进行培养或其他无菌操作时还需要进行火焰消毒。

吸取不同的液体、处理不同的细胞要用不同的吸管，避免液体间、细胞间的交叉污染。

4.2原代培养

从培养箱中取出培养瓶，拧紧瓶口，在超净台内75%的乙醇混合液擦拭消毒，将培养瓶中的培养液弃掉，抽取约8-10mL的新培养液于培养瓶中，拧紧盖子，75%的乙醇擦拭消毒后瓶口火焰消毒，拧松盖子放回培养箱。

4.3传代培养

4.3.1传代前准备

1.预热培养用液：

把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2.用消毒液擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

3.正确摆放使用的器械：

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4.点燃酒精灯：

注意火焰不能太小。

5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。

（采用高压灭菌，玻璃瓶铝箔封口，直接用布包裹两层，小物品及小玻璃品吸管放入铝饭盒，包裹饭盒两层）

6.取出预热好的培养用液：

取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7.从培养箱内取出细胞：

注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

8.打开瓶口：

将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

4.3.2胰蛋白酶消化

1.加入消化液：

小心吸出旧培养液，用培养液清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

2.显微镜下观察细胞：

倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

3.吸弃消化液加入培养液：

弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

4.3.3吹打分散细胞

1.吹打制悬：

用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2.混匀细胞：

用滴管吹取数次以混匀细胞悬浮液。

4.3.4分装稀释细胞

1.分装：

将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖，每个培养瓶中补齐10mL。

2.显微镜下观察细胞：

倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。

注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。

最后要做好标记。

4.3.5继续培养

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。

传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。

当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

细胞传代细胞培养注意事项：

1.严格的无菌操作

2.适度消化：

消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

4.4MTT法筛选药物活性

4.4.1种板

贴壁细胞用0.25%胰酶消化后，悬浮于10mL含5%胎牛血清的DMEM培养液中，用玻璃管轻轻吹打成单细胞悬液,并平分到两个培养瓶中，每个培养瓶中再加入35mL的培养液，约配成细胞浓度1000-3000个/100μL。

96孔培养板每孔加细胞悬液100μL（对照组只加培养基100μL不加细胞液），细胞接种后，在37℃温度，100%相对湿度，含5%CO2、95%空气的培养箱预培养24h。

（细胞加量多少是安实验计划计算的，一般都要设计空白和阳性对照，但96孔板，每孔加量总量最多为200μL，加药后培养时间也不是固定的，）

4.4.2细胞计数方法

1.将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2.将细胞悬液吸出10ul，取少量细胞悬液加等量的0.4%台盼蓝染液，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞（台盼蓝不着色的为活细胞）滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3.静置1分钟。

4.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数

　注意：

镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

4.4.3初始浓度化合物的配制

称取一定量的化合物用DMSO溶解（DMSO的用量终浓度不超过0.1%）再加入相应体积的培养液，配成初始浓度，在超净台内用0.22μm的滤器过滤除菌，加药时在用培养液稀释成四个梯度浓度。

4.4.4加药

设置空白组，阳性对照组，给药组，每孔加50μL药液共设置3个副孔，将初浓度配置好的药物按照梯度稀释所需要的终浓度进行点板，在37℃温度，100%相对湿度，含5%CO2、95%空气的培养箱预培养24h。

培养板的设置是根据需求设定的但每一个浓度最少要有三个副孔，培养板的外圈孔加入等量的PBS，防止边缘效应和污染。

4.4.5加MTT

每孔加入10μL5mg/ml的MTT溶液（用生理盐水或PBS配制），继续培养4h。

4.4.6加DMSO

仔细吸去上清液（悬浮细胞需先离心），每孔加入100μL二甲基亚砜，轻轻震动使甲臜溶解。

摇床摇晃0.5h后在570nm波长处测OD值,抑制率%=（对照空平均OD值-化合物孔平均OD值）/对照空平均OD值,通过回归计算得出IC50值

4.5细胞冻存

1.选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。

将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。

适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。

用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液，悬浮生产细胞则不要消化处理。

然后将细胞收集于离心管中，密封瓶口，离心（1000r/min，10分钟）。

2.75%乙醇擦拭离心管，离心管口火焰灼烧灭菌，弃去上清液，加入配制好的冻存液（4℃保存），用吸管吹打成单细胞的悬浮液。

3.将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。

冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

4.采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：

先将安瓿置入4℃冰箱中0.5小时，再移至冰箱冷冻室-20℃内1小时（此步可省略），再冰箱-84℃过夜，再吊入液氮容器颈气态部分存放1小时，最后沉入液氮中。

细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

4.6细胞复苏

1.佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

2.迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，75%乙醇擦拭后打开冻存管，无菌玻璃管吸入无菌离心管，封口。

3.在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。

若细胞密度较高，及时传代。

或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，弃去上清液，换入新鲜培养基继续培养。