细胞免疫荧光实验步骤_精品文档.doc

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细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤

简单实验步骤如下:

1.漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.

2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟

3.PBS洗净:

3min＊3

4.1%Triton:

25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5.PBS洗净:

2＊5min

6.羊血清封闭：

３７度，２０分钟

７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度　１－２小时

８.４度　PBS洗净，３min＊５次

９.二抗　３７度小于一小时

１０.３７度　PBS洗净，３＊５min

　　凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）　　

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

（一）制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、

　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为

　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）

　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS

　　　　　　　　稀释）灭活正常兔血清

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min

　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右

　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠

　　　　　　　　　（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃30min

　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右

　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入

　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，

　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液）

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察

　　　　　　　　　　（标本在试管中可保存5～7天）

（二）试剂和器材

　　1.　各种特异性单克隆抗体。

　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

　　3.　10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。

　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项

　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

　　附:

　　1.DPBS（×10,贮存液）

　　　　NaCl80g

　　　　KCl2g　　　　　蒸馏水加至1000ml

　　　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释

　　　　KH２PO４2g

　　2.　洗涤液

　　　　DPBS　　　　　　900ml

　　　　FCS50ml（终浓度　5％）

　　　　4％NaN３?

?

?

50ml（终浓度0.2％）

　　3.　固定液

　　　　DPBS　　　　1000ml

　　　　葡萄糖　　　　20g（终浓度2％）

　　　　甲　醛　　　　10ml

　　　　NaN３　　　0.2g（终浓度0.02％）

4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项

　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

　　附:

　　1.DPBS（×10,贮存液）

　　　　NaCl80g

　　　　KCl2g　　　　　蒸馏水加至1000ml

　　　　Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释

　　　　KH２PO４2g

　　2.　洗涤液

　　　　DPBS　　　　　　900ml

　　　　FCS50ml（终浓度　5％）

　　　　4％NaN３?

?

?

50ml（终浓度0.2％）

　　3.　固定液

　　　　DPBS　　　　1000ml

　　　　葡萄糖　　　　20g（终浓度2％）

　　　　甲　醛　　　　10ml

　　　　NaN３　　　0.2g（终浓度0.02％）

严重同意楼上的讲解。

我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！

排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。

我想请问楼上：

NaN３哪里有卖？

谢谢！

我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！

是不是不是同一种东东？

我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：

1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟

3、4％的甲醛室温固定20－30分钟

4、1×PBS洗3次，每次10分钟

5、0.2％TritonX－100透化2－5分钟

6、1×PBS洗3次，每次10分钟

7、5%BSA室温封闭30分钟

8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜

9、1×PBS洗3次，每次10分钟

10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！

！

！

11、1×PBS洗3次，每次10分钟

12、95％甘油封片

注：

4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释

从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光

我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：

有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2.4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3.0.2％TritonX－100通透10分钟，PBS洗三遍。

4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

建议：

1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。

2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适

各位同仁:

我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。

不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。

请高手指教。

万分感谢！

能发一个邮件更好，再一次感谢！

我的E-mail：

hudaxj2005@

抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间

bu不是原创

我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。

（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少）

顶一下

我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？

另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理？

我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法，找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。

。

。

不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定