MTT所有问题汇总.docx

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MTT所有问题汇总

MTT所有问题汇总

　　其它的声音：

　　1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。

尤其是对于肿瘤细胞。

10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。

　　2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。

特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。

　　3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度，用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组，于细胞少，药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性来确定培养时间是48小时还是72小时.

　　注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。

加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。

虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。

另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。

所以要熟练鞋、快些上板。

　　实验前应明确的问题

　　1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

　　2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！

否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

　　3.时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了那个时间点应该就是最好的时间点。

　　4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

　　5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

　　7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

　　8.避免血清干扰。

用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤悬浮细胞：

　　1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640培养基40ul；②加ActinomycinD10ul用培养液稀释；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul，共100ul加入到96孔板。

每板设对照。

2.置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　3.每孔加入10ulMTT溶液，继续培养4h。

，直接酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值）

　　4.离心，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。

　　5.同时设置调零孔，对照孔，每组设定3复孔。

　　贴壁细胞：

　　1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，。

　　2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

　　4.每孔加入20ulMTT溶液，继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.终止培养，小心吸去孔内培养液。

　　6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

　　7.同时设置调零孔，对照孔MTT的配制

　　MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

　　MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

　　配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方：

NaCl8gKclNa2HPO4KH2PO4调ph定容1L

　　关于细胞的接种

　　细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的，不好的板或重复利用的板只可做预实验。

　　接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率的所呈现的线性关系最好，结果最可信。

如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。

且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。

故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

　　细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。

悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104.首先说说我的一点经验：

　　1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。

10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：

悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

。

　　2.吸管的吸液量最好在1ml左右：

吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。

如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益

　　3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

　　4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了

　　5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。

所以速度不能太快也不能太慢。

我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。

　　2.我每次将MTT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G，5min。

但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。

所以还是建议翻转倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接将板翻转倒扣2-3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。

可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。

假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。

4.做MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。

因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。

悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。

　　5.加完MTT反应3-4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶，使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有

　　的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。

不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。

　　6.用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！

这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液，觉得比其它方法可靠，一般不会吸走紫色结晶.避免清除上清而改进的方法

　　于一般可离心96孔板的离心机不好找。

既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。

　　解决方法1：

用以下文献方法：

周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24：

455-457具体方法：

　　配溶解液：

10%SDS，5%异丁醇，/LHCL，蒸馏水溶解。

　　溶解液：

SDS10g，异丁醇5ml，10MHCl用双蒸水溶解配成100ml溶液操作：

在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如需给药，则再于同时或4h后加入不同浓度的药物10ul/孔，均设三复孔。

另外，每块板上另没一个调零孔。

培养2d后，加入MTT溶液20ul/孔，继续培养4h，然后加入上述液100ul/孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值。

优点：

简化操作，提高了可靠性。

　　解决方法2：

日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂，CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：

该试剂中含有WST–8[其化学名称为：

2--3--5--2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料。

生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。

因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。

★优点

　　1、简便只需一步即可得到结果2、省时毋需预制，即开即用

　　3、安全毋需放射性同位素和有机溶剂4、快速省去了溶解除沉操作5、灵敏度高灵敏度高于MTT

　　6、重现性好步骤少；无损失；结果准确就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的。

★进行细胞增殖分析的使用方法：

　　1、接种细胞悬液100μl于96孔板内，预先置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养。

2、在每个孔内加入10μl的CCK-8试剂。

3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。

　　4、在450nm波长处测定吸光度，参比波长为600nm或600nm以上。

解决方法3：

使用MTS解决方法4：

加入DMSO

　　在同一批实验中最好不要更换DMSO。

加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到，会对最后结果造成影响。

但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差，所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。

如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.

　　1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min，时间控制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不可信.

　　2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。

如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。

　　3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

　　振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的：

扎破气泡.有气泡存在时，于其对光的反射与折射作用，会导致结果偏移.OD值的测定

　　至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫色，490nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。

；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

　　DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.

　　细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。

如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染，空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。

　　复孔直接的OD值差别一般应在，差别太大考虑：

1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000-10000个。

可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。

2.贴壁时间：

18-24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。

　　一般为了实验的准确，每个浓度可以设5-6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！

。

　　MTT方法的吸收度在~之间误差较小。

这和分析化学中的lambert-beer定律有关，对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象。

这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。

若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。

在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要。

任何光度计都有一定的测量误差。

这些误差可能光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

　　在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。

吸光度标尺刻度不均匀。

对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。

吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。

待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.

　　2~之间，才能保证测量的相对误差较小。

当A=时，测量的相对误差最小。

其它的声音：

　　1.最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。

用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。

　　2.我们用的BIO-TEK公司的ELx800，一般值在2以下都是可靠的，如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差.我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在范围内可能更佳，若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。

边缘效应

　　96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低，96孔板在培养箱中，于湿度不够，而培养箱于具有一定的温度，于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。

对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。

解决方法：

将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸发就可以.关于如何计算IC50

　　改良寇式法：

lgIC50=Xm-I/4）Xm：

lg最大剂量

　　I：

lgP：

阳性反应率之和Pm：

最大阳性反应率Pn：

最小阳性反应率

　　举个例子：

各组浓度、、、、、，稀释倍数为10，最大浓度为，抑制率为、、、、，。

代入计算公式：

Pm=Pn=

　　P=+++++=Xm==-1lgI=/=1

　　lgIC50=-1-1*/4）=-IC50=

　　Bliss法：

自己查阅书籍IC50计算软件，见下面附件

　　自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！

　　在线求IC50或EC50：

/javastat/结果统计学处理

　　所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<时为相差显著，p<时为相差非常显著。

可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。

或计算抑制率。

细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组

　　excel表中可以做两两比较的T-test，这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。

用的软件是SPSS或者SAS。

孔板的重复利用：

　　培养板要用好的，不好的板或重复利用的板只可做预实验。

一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。

悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。

建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次，底值最好在测得值的1/3一下。

　　强烈建议培养板不要重复使用：

1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一，则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.重复利用时做法1：

　　洗净后用2%NaoH浸泡4小时，再用1%稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜做法2：

　　泡酸2-4小时，老师让我们别超过4小时，。

捞出，冲洗干净，烘干后，UV照射过夜。

估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒。

做法3：

　　1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时。

　　2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干。

　　3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液后自来水洗净每个孔都要处理。

　　4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干。

　　5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。

做法4：

　　1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干备用。

此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。

　　2、每孔加入50-100ul的胰酶，我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。

假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内。

对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。

3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干备用。

　　如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。

4、将晾干的96孔板泡酸过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。

三蒸水冲洗3遍。

烘干备用。

泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。

　　5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。

紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。

注：

　　1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。

拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。

你会发现孔高的值又会到正常水平。

因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

　　2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。

你不妨在做实验前测一次96孔板的值，实验测得的为后值。

后值减去初值就接近实验的真实值。