沙门氏菌检测方法的研究进展.docx

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沙门氏菌检测方法的研究进展

沙门氏菌检测方法的研究进展

摘要：

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，而且，沙门氏菌的检验在食品检测中具有重要意义。

建立一种快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。

本文通过查阅大量文献，详细阐明了沙门氏菌的各种快速检测方法的原理，对近年来沙门氏菌的检测进展进行了综述。

认为，传统方法可以对沙门氏菌做出鉴定，但需要4~7d的时间；以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，且灵敏性高和特异性强；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。

但是这些方法仍然存在一定的不足，需要进一步加以改进，关于食品中沙门氏菌的检测方法的研究还有待进一步深入。

关键词：

沙门氏菌；检测；传统方法；免疫；分子

前言

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病之一，沙门氏菌属于肠杆菌科细菌，由此类细菌引起的各种动物的疾病称为沙门氏菌病。

沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性，属于偏嗜性沙门氏菌，绝大多数对人和动物均适应，可寄居在哺乳类、爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中，种类繁多的家养和野生动物的感染率在1%—20%或者更高。

故各种家禽、家畜在喂养、屠宰、运输、包装等加工处理过程中均有污染的机会。

各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。

除初生动物，人畜感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌，污染肉蛋产品，同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病，可能加重病情或者增加死亡率，或者降低动物生产力等，对养殖业的经济效益影响较大，并严重影响人类健康。

近年来，随着免疫学实验技术和分子生物学技术的发展，沙门氏菌检验技术的研究也有了新的研究进展。

本文将近年来国内外关于沙门氏菌检验技术研究进展情况作以概述，供参考。

1传统的检测方法（国标法）

常规检验技术基本特征与步骤:

沙门氏菌常规检验技术具有以下3项特征：

常规方法是编入国标方法或国际方法中的基本方法，是检验其他检测方法准确性、敏感性的参照；常规方法最终将能分离到细菌纯培养物；常规方法简单、准确、可重复性强、有一定的灵敏性。

随着经济和技术的发展以及研究的深入，标准方法也处于不断进步，不断更新中。

常规检验包括以下5个基本步骤：

前增菌和增菌；分离纯培养物；属和种的鉴定；血清学分型；菌型的判定和结果报告。

在具体实践中用此方法检测畜产品中的沙门氏菌时，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。

虽然该方法鉴定结果准确可靠，但由于沙门氏菌血清型繁多，生化特性各异，检验程序复杂，耗时长，至少需要4~7d才可得到准确的检测结果[1,2]。

2免疫学标记检测方法

免疫标记技术就是将已知抗体或者抗原上标记上易显示的物质（标记分子），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接检测出微量的抗原或者抗体。

所谓的标记分子是那些即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出来，高敏感性的标记分子主要有突光素、酶、放射性同位素3种。

免疫标记技术不仅大大提高了试验的敏感性，和光镜或电镜技术结合后，能对待检物质做精细定位，为临床研究和诊断提供了极大的方便。

由此建立的沙门氏菌免疫学检测方法有多种，包括免疫酶标记技术，使用较多的如酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）和免疫荧光抗体技术，以及斑点免疫金渗滤法和免疫磁性分离法等。

2.1酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA的原理是是把抗原或抗体预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原或抗体使其与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质含量[3]。

1977年，Kryinski和Heimsch首次将ELISA技术用于食品沙门氏菌的检测[4]，随后国内外许多研究者也都将ELISA方法应用于沙门氏菌的检测工作，但由于其使用的大多是多抗血清，特异性不强，和其他肠科奸菌以及相近的细菌存在不同程度的交叉反应性，假阳性率较高,、，在实际使用和推广中有一定困难。

单克隆抗体具有特异性高、纯度高、效价高、重复性好、无交叉反应及无限量生产的优点，将其应用于沙门氏菌ELISA检测方法中，能极大提高检测方法的特异性、灵敏性和准确性。

1995年，焦新安等获得了4株具有沙门氏菌广谱结合特性的单克隆抗体,其中2株的反应互补，对已检菌株覆盖率达99%，而对其它受试肠杆菌均无交叉反应[5]。

之后，文其乙等在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和de7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法,并形成了快速检测试剂盒，此外，还应用直接ELISA方法对500份蛋品检测,结果表明该方法可靠，且阳性率比国标方法高[6,7]。

1998年，田银芳等应用直接ELISA法对350份奶样进行沙门氏菌的检测，与常规方法相比,该法的灵敏度和特异性分别为100%和99.7%；2003年，杨爱萍等也成功地用单抗酶联试剂盒检测鲜牛奶、熟食制品等样品中的沙门氏菌[8,9]。

大量的试验结果表明,单抗直接法灵敏度高、特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品，检测周期短，且不需昂贵仪器，易于操作，便于推广。

2.2斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）

Dot-ELISA是以纤维素膜作为固相载体的一种新型免疫检测技术，其原理与常规ELISA法相同，可用于抗原或抗体的定性或定量检测。

其与ELISA的不同之处在于：

一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、确酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮节氧甲基化纸等固相化基质膜代替，用以吸附抗原或抗体；二是显色底物的供氢体为不溶性的，结果在基质膜上出现有色斑点进行判定。

该方法具有简单、快速、灵敏、特异性强等特点,并具有较高的可重复性，而且阳性反应色斑易于观察,阳性检出率也高于常规分离培养法，且整个操作过程不需要任何特殊仪器，适用于大批量样品的快速检测，可以节省大量人力、物力、财力，便于在基层单位推广应用。

蔡家利等应用Dot-ELISA法检测加工肉制品中沙门氏菌，共200份样品，与常规细菌学检验法进行对比检验，检出结果总符合率为96.65%[10,11]；张红见等应用Dot-ELISA法对85份猪胴体进行了沙门氏菌的检测[12]。

结果表明，在85份肉样中，Dot-ELISA检出沙门氏菌阳性65份，阳性率为76.47%，检测结果与常规方法一致。

康明等应用Dot-ELISA检测鱼粉85份，结果表明，64份为阳性，常规分离培养法53份为阳性，两种方法差异不显著[13]。

雷风等应用Dot-ELISA法检测鱼粉85份，结果沙门氏菌的最低检出量为400个/mL，阳性检出率为43.00%，常规分离培养阳性检出率为38.00%，两者总符合率为83.72%，差异不显著（P>0.05）[14]。

由此可见，该方法简便、特异、快速、结果直观，便于在基层推广使用[10]。

2.3免疫荧光抗体技术

免疫荧光抗体技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。

在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

孙洋等人利用吖啶橙标记免疫血清，用吖啶橙免疫荧光菌团培养法检测沙门氏菌，证明该检测方法对于34个菌/ml的沙门氏菌均可检出，与枯草杆菌，肠埃希氏杆菌等八种杂菌均不形成菌团交叉，与杂菌的浓度比在1:

640之内均不受干扰，30h内即可获得结果[15]。

缩短了检测时间，而且具有敏感性高，特异性强，简便快速等优点。

除采用免疫荧光标记方法检测，Cloak等利用表面吸附将检测样品吸附于载于玻璃斜面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。

该方法可检测到103.5个沙门氏菌/ml，而不呈现假阴性和假阳性反应[16]。

Kyrinrki和Heimarch（1977）用荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，该系统中有一个直径47mm的薄膜滤器，在滤器上可同时检测14个样品[17]。

2.4其它免疫学标记检测方法

斑点免疫金渗滤法是借助酶联免疫原理，使点在硝酸纤维膜上的样品与胶体金标记的兔抗沙门氏菌抗体结合，若样品中含有沙门氏菌，与胶体金标记的兔抗沙门氏菌抗体结合，形成金标抗原抗体复合物，滞留在硝酸纤维膜上并显色，可得到直观的检测结果，该法操作简便，快速[18]。

免疫磁性分离法是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，通过与样品中靶细菌的特异性结合和外加磁场的作用，使靶细菌得到分离、浓缩[19]。

此技术直接检测细菌特异性好，但灵敏度低。

3.分子生物学方法

目前分子生物学技术发展日新月异，而沙门氏菌的分子生物学技术也有很大的发展。

现代分子生物学技术如核酸探针，聚合酶链式反应技术（PCR），环介导等温扩增技术（LAMP），基因芯片技术和核苷酸序列分析等都在沙门氏菌的快速检测种发挥着重要作用。

3.1核酸探针

目前，检测沙门氏菌的探针的属特异性沙门氏菌探针已从鼠伤寒沙门氏菌E23566菌株染色体DNA克隆成功，并用于检测食品中沙门氏菌的存在。

1983年，Fitts等描述了鼠伤寒沙门氏菌DNA片段，用其作探针对300多种常见和不常见血清型沙门氏菌做DNA杂交试验，结果所有测试的沙门氏菌都被检出来，而近源的非沙门氏菌没有发现同源核苷酸序列[20]。

Rubin等制备的探针，对于伤寒沙门氏菌快速鉴定非常便利，能对混合细菌样品在样品采集后几小时内快速检测出伤寒沙门氏菌。

更精细地区别沙门氏菌，可以通过酶切质粒DNA来进行，它主要采用一定数量的限制性内切酶，对提纯质粒的DNA酶切，分别得到不同DNA片断，目前已成功地应用于伤寒沙门氏菌的检验中，并建立了菌株的指纹图谱。

80年代中期发展起来的以放射性同位素标记的核糖体核糖核酸（rRNA）探针，用rRNA为靶序列来探测特异性微生物的存在为细菌的分类提供了一种全新的方法[21]。

3.2聚合酶链式反应技术（PCR）

PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。

目前，PCR技术是一种快速、简便、特异、灵敏检测沙门氏菌的方法。

1992年，Rahn等首先设计出1对引物，用PCR检测沙门氏菌,检出率为97%，但许多肠道杆菌能同时扩增出来，特异性较差[22]。

1999年，章新生等根据Cohen报道的寡核苷酸序列合成1对引物用于沙门氏菌的诊断，并对其特异性和扩增产物进行了验证[23]。

2004年，黄金林根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物序列，成功扩增出495bp沙门氏菌特异条带，而阴性对照则无此条带，从而建立了应用PCR进行沙门氏菌快速检测的方法[24]。

3.3环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术的原理是针对靶基因的6个区域按照规定的顺序设计4种特异的引物，因此LAMP技术扩增的特异性很高，只要出现扩增就可以判定靶基因存在。

同时，在DNA延伸合成过程中，从dNTP中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生白色的焦磷酸镁沉淀。

因此只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否[25]。

LAMP技术具备操作简单、特异性强、反应快速、灵敏度高的特点，LAMP技术在微生物检测方面上得到了广泛的应用。

3.4基因芯片技术

基因芯片是一种固定有很多已知序列DNA探针的硅片或玻片。

将经过荧光标记的样品分子与基因芯片上的DNA探针进行杂交，通过检测每个探针分子的荧光信号强度以得到样品分子的数量和序列信息，基因芯片表面的DNA探针从几十到几百万个不等，可以一次性检测多种病原菌，并同时得到病原菌的耐药性等情况。

Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙门氏菌抗原和毒力因子与其致病性的关系，发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测[26]。

4.其他检测沙门氏菌的方法

4.1噬菌体法

噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。

何晓青等（1984）发现一种称作肠杆菌科分属诊断噬菌体，鉴定沙门氏菌只要6min，加上培养菌落时间只需2d。

其方法是挑取鉴别培养基上的可疑菌落，作胨水培养（37℃过夜），若菌液浑浊，作1:

200稀释，再用灭菌棉签在烘干的琼脂平皿上作条状涂布，待平板菌液干燥后，用微量加样器依次在每个区域滴加沙门氏菌噬菌体进行裂解试验。

张碧波等在应用噬菌体快速检测沙门氏菌时，对100个肠杆菌菌株进行噬菌体O-I裂解试验，30株沙门氏菌全部为阳性，而其余非沙门氏菌株全部为阴性，与前人的研究结果一致[27]。

4.2微量热量测定法

微热量计技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别[28]。

微生物在生长过程中产生热量，虽然产生的量很小，但仍能通过敏感的微热量计进行测量。

用微热量计对微生物计数时，温谱图必须与绝对微生物细胞数呈相关性，一旦建立了参考温谱图，食品样品温谱图便可与之相比较而得到微生物的绝对数量。

5.小结

随着社会发展与科技进步，新的微生物检验方法和手段不断涌现，这些检测方法的检测结果与传统检测方法大体一致，能够快速、可靠的检测出食品中的沙门氏菌。

分子生物学检测法快速、灵敏、特异性强，但成本较高，且要求较高技术水平，大范围应用尚有一定难度。

在分子生物学法中，应用最为广泛的是聚合酶链反应技术（PCR）。

PCR是一种体外核酸扩增技术，目前，国内外学者应用此项技术检测食品中致病菌，取得良好效果。

免疫学法不但经济实用、重现性好、灵敏度高、特异性较强，特别是近几年发展的免疫试剂盒，不仅适用于防疫及卫生监督部门，还可在企业及家庭卫生检测中使用[29]。

在免疫学法中，酶联免疫吸附（ELISA）应用较为普遍。

随着国内外学者相关研究及探索的不断深入，ELISA技术在食品微生物检测中将会发挥更为重要的作用。

总之，研究沙门氏菌的检测方法，随着检测技术的发展，检测方法越来越快速、检测结果越来越准确、操作程序也越来越简单。

但各种方法都存在着不同程度的缺陷，有待于进一步改进和完善。

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