综述药用植物银杏及其内生真菌代谢活性物质研究概况.docx
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综述药用植物银杏及其内生真菌代谢活性物质研究概况
药用植物银杏及其内生真菌代谢活性物质研究概况
摘要：
药用植物内生真菌可产生与宿主相同或相似的多种次生代谢产物,有些是新物质,具有特殊的生理功能，是药物研究的重要来源，银杏（GinkgobilobaL.）是珍贵的药用植物资源,不同生长时期、不同部位含有多种内生真菌，表现出丰富的多样性，是分离多种内生真菌和代谢活性物质的重要来源，银杏属于濒危珍稀植物,资源有限,利用内生真菌发酵生产物质具有广阔的开发利用前景。
毛壳菌（Chaetomiumsp.）对多种植物病原菌产生拮抗作用，从植物体内分离到的内生毛壳菌发酵产物中分离到多种具有生物活性作用的次生代谢物，包括抗癌物质球毛壳甲素、抗氧化活性物质、抗菌活性物质以及细胞毒活性物质等具有重要作用的生物活性物质，其中球毛壳菌是分布最广泛的毛壳菌，因而利用内生真菌球毛壳菌发酵生产植物药用活性成分具有较大的潜力。
本文综述了多种药用植物内生真菌及其代谢生物活性物质多样性研究概况，主要介绍了银杏内生真菌及其代谢产物多样性以及内生球毛壳菌活性代谢物研究进展。
为进一步研究银杏内生真菌球毛壳菌发酵产物活性成分的提取分离提供理论依据。
关键词：
内生真菌；药用植物；银杏，球毛壳菌；生物活性代谢物
内生菌与植物在进化中形成互惠共生关系，对药用植物活性成分产生和积累有重要作用。
分离自药用植物的内生真菌可以产生很多种生物活性物质，本文综述了多种药用植物内生真菌及其代谢生物活性物质多样性研究概况，主要介绍了银杏内生真菌多样性以及内生球毛壳菌活性代谢物研究进展。
为进一步研究银杏内生真菌球毛壳菌发酵产物活性成分的提取分离提供理论依据。
一、内生真菌及其代谢产物多样性
1、内生真菌多样性
内生真菌是指某一时期生活在活的植物组织内而不引起明显病害症状的真菌。
在长期的进化过程中,内生真菌与宿主植物形成紧密的互惠共生关系,除了从宿主处获得自身生长所需的营养物质外,一些有益的内生真菌还能产生多种活性代谢产物提高宿主植物的抗逆性、促进植物生长。
近十多年来,人们从47科81属114种3变种药用植物中分离到的内生真菌达到171属,涉及到子囊菌、担子菌、接合菌、卵菌、有丝分裂孢子真菌（Mitosporicfungi）及其无孢菌类（Myceliasterile）等真菌类群,其中子囊菌40属、担子菌3属、接合菌3属、卵菌3属;其余122属为有丝分裂孢子真菌,包括丝孢菌（Hyphomycetes）82属、腔孢菌（Coelo2mycetes）32属和其它类群（Stromatic和Sclerotial）8属,具有丰富的物种多样性。
已有的研究表明,不同种类的植物中,内生真菌的种类和数量不同。
2、内生真菌活性代谢产物多样性
普遍存在于植物体内的内生真菌具有丰富的多样性,是一类巨大的生物资源,代谢过程中产生的各种活性物质具有不同的生物活性作用，与人们的生产、生活关系密切。
2.1萜类化合物2.2生物碱类化合物2.3苯丙素类化合物2.4黄酮类化合物2.5甾体化合物2.6醌类化合物2.7糖类物质2.8有机酸类物质2.9 脂类物质2.10肽类物质2.11其它活性物质
二、药用植物内生真菌的研究
我国药用植物资源丰富,有记载的药用植物11020种,隶属2313属、383科,约占药资源总数的87%。
但目前能进行人工栽培的药用植物仅400多种,绝大多数的药用资源来源于野生种类。
尤其是近年来,人类对药物特别是天然药源药物的需求量剧增，微生物具有生长繁殖快,易培养,易控制,产量高,不受季节、气候、地域等自然条件的限制,发酵成本低,使得有望通过植物内生真菌发酵为一些重要的药物生产开辟新途径,因此具有极大的开发潜力和应用价值。
许多药用植物已被开展内生真菌研究,主要研究方向为从这些药用植物内生真菌中发现与宿主相同或相似的药物,以及新的活性化合物,或者内生真菌对宿主的有益作用方面。
目前已研究过内生真菌的药用植物至少有145种。
1、药用植物内生真菌及其代谢产物多样性
药用植物内生真菌具有丰富的多样性,不同部位间存在差异。
且不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异，同时还包含着大量的没有认知的新物种.不仅药用植物内生真菌的种类具有多样性,这些内生真菌中具有相同作用的真菌以及不同的内生真菌所产的次生代谢产物也具有丰富的多样性。
2.、药用植物内生菌产生的活性成分及其作用多样性
根据内共生理论,内生真菌可能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物,而药用植物是中药的重要来源,因此药用植物的内生真菌可能产生与中药相同或相似的化合物。
药用植物内生真菌一直是近年来筛选一些重要医用药物的理想途径,近年来在植物内生真菌中发现的有益次生代谢产物的结构类型主要有:
萜类、黄酮类、异香豆素类、醌类、生物碱类、苯并呋喃类、多肽类、甾体化合物等。
内生真菌可产生与宿主相同或相似的活性物质,但更容易从内生真菌中筛选到新化合物。
药用植物内生真菌产生丰富多样的活性物质,这些活性物质的作用包括:
抗肿瘤作用；抑菌作用；免疫抑制作用；植物生长调节作用；其他作用等。
2.1抗肿瘤活性成分
2.1.1萜类化合物如由紫杉属植物内生菌产生的紫杉醇。
2.1.2生物碱胞松素类物质（Cytochalasins）一些内生真菌如炭角属（Xylaria）、茎点霉属（Phoma）、炭团菌属（Hypoxylon）等是产生生物碱特别是胞松素类化合
物的代表属真菌。
2.1.3苯丙素类抗肿瘤化合物如从桃儿七的茎中分离到可产鬼臼毒素的内生真菌从野茼蒿Crassocephalumcrepidioides中分离到能产生异香豆素类似物的内生真菌等。
2．1.4Torreyanicacid，Torreyanicacid是一种选择性的具有细胞毒的苯醌二聚物,由一株分离自佛罗里达榧树（Torreyataxifolia）的内生真菌（P.microspora）产生的。
2.1.5其他抗肿瘤活性化合物从植物内生真菌特别是药用植物内生真菌中发现分离到的抗肿瘤活性成分至少有10种以上。
2.2抗菌类活性成分
2.2.1Cryptocandin与CryptocinCryptocandin是一种多肽化合物,具有抗霉菌活性,是由分离自药用植物雷公藤的内生真菌（Cryptosporiopsiscf.quercina）产生的。
2.2.2Ecomycins与PseudomycinsEcomycins是一类结构新颖的脂肽类化合物,分子量分别为1153和1181。
是由寄生于禾本科植物叶中的绿黄假单孢菌（Pseudomonasviridiflava）产生的。
2.2.3P.microspora产生的抗菌活性物质拟盘多毛孢属真菌（Pestalotionpsisspp.）是一类广泛寄生于热带植物的内生真菌,被喻为热带植物的E.coli!
2.2.4Munumbicins和KakadumycinsMunumbicins是一种多肽化合物,分子量从1269到1326不等;其产生菌是从植物（Kennedianigriscans）中分离出的一种放线菌链霉菌（StreptomycesNRRL30562）。
2.3免疫抑制活性Strobel等从一种具有免疫抑制活性的中药植物中发现了一株能产免疫抑制活性物质粘霉醇的内生真菌。
另据报道,少数内生菌还可以产生抗病毒物质、胰岛素类似物等活性成分。
2.4其他活性物质：
抗病毒活性化合物、杀虫活性物质、抗氧化剂、降血糖活性物质等。
3药用植物内生真菌与宿主的互作关系内生真菌与宿主植物形成互惠共生关系,除了从宿主吸收营养物质外,内生真菌还能通过自身的代谢活动为宿主提供一些有益的特性。
药用植物内生真菌不但具有产生与宿主相同或相似的次生代谢产物,还可以通过特异性作用促进药用活性物质产生。
2.4.1内生菌对药用植物活性成分产生和积累的影响
一、内生菌自身能产生药用植物活性成分
二、内生菌能促进药用植物产生活性成分
2.4.2研究内生菌与药用植物活性成分关联性的途径
2.4.2.1从药用植物分离内生菌,再分析内生菌产生的活性成分：
首先选取有药用价值的植物,经过表面消毒后,从根、茎、叶、花等组织中分离得到内生菌,再用合适的培养基培养内生菌,然后利用光谱、色谱及分子生物学等手段和方法分析内生菌的次生代谢产物,目的是得到药用植物的活性成分。
前面所述的内生菌自身产生药用植物活性成分的研究大部分是采用这种方式进行的。
2.4.2.2内生菌与药用植物共培养,再检测活性成分的产量：
内生菌分离纯化后,与药用植物组织或细胞悬浮液共培养或发酵,然后检测药用植物活性成分的产量是否增加,或是否有新的药用活性成分产生。
三、银杏内生真菌种群及其次生代谢产物多样性
银杏（GinkgobilobaL.）是多年生落叶乔木,为我国特有树种,也是珍贵的药用植物资源,具有广阔的开发利用前景。
但由于银杏属于濒危珍稀植物,资源有限,生长又很慢,长期大量开发将会造成银杏资源的枯竭。
采用微生物工程技术,利用内生真菌发酵生产代谢活性物质也是一条重要的途径。
植物内生真菌对植物某些活性成分的形成有重要影响,会产生与其宿主相同或相似的生理活性成分,因而利用内生真菌发酵生产植物药用活性成分具有较大的潜力。
1、银杏根、茎、叶、种子4个部位内生真菌种群多样性
从银杏（GinkgobilobaL.）根、茎、叶、种子中分别分离获得内生真菌16、22、38和14株,共计90株。
经形态观察分类鉴定为6个目、7个科、22个属。
银杏内生真菌中,在目的分类水平上,以黑盘孢目（Melanconiales）和丛梗孢目（Moniliales）为优势种群;在属的分类水平上,以球壳孢属（Sphaeropsis）和刺盘孢属（Colletotrichum）为优势种群。
银杏不同部位内生真菌的数量、分布、种群及其组成存在差异。
为研究开发利用银杏资源提供了理论依据。
1.1银杏不同部位内生真菌的分布通过对银杏不同部位的内生真菌进行分离,发现分离植物组织和部位不同,分离获得的内生真菌种类就不同,而且分离频率不同（图1）银杏的根、茎、叶、种子等不同部位内生真菌在数量、种群分布和优势种群方面都有很大差异，表明了银杏内生真菌的数量和种群的多样性特点。
1.2同种植物在不同的生长时期和不同的季节,内生真菌也存在不同
春、夏、秋三季分离的银杏植株进行分析，发现老叶的组织分离率即平均每块组织可分离到的内生真菌的数目最高,其次是老树皮，根和果实的组织分离率最低,结果显示银杏组织中存在丰富的内生菌,不同组织内生真菌的数量存在一定差异。
同时表明，银杏叶部组织中内生真菌的类群与分布在不同地理生境下也存在着差异，也呈现一定的规律性，内生真菌的类群和分布可能受到地理位置及其气候环境等因素的影响，不同地区银杏叶部组织的内生真菌在春季的种群数量及分离率都是最少和最低的，而在夏季和秋季均有很明显的升高。
多样性指数的计算反映出所获得的银杏叶部内生真菌菌群具有不同的丰富度及均匀度，同时有一定的相似性。
2、银杏内生真菌次生代谢产物的研究
2.1从银杏（GinkgobilobaL.）树叶中分离得到一株内生真菌EG4,经鉴定为刺盘孢Colletotrichumsp.,结果表明该真菌能够产生黄酮类化合物。
2．2采用柱层析方法从银杏叶内生真菌ChaetomiumglobosumZY22的培养菌丝体提取物中分离得到脑苷脂B
（1）、脑苷脂C
（2）、尿囊素（3）、9（11）-去氢麦角甾醇过氧化物（4）以及4,6,8,22-四烯-3-酮-麦角甾烷（5）和球毛壳甲素（6）共6个次生代谢物，表现出不同的生物活性。
2.3银杏内生菌的分离鉴定及生物活性研究表明，抗菌活性较好的主要是属于青霉属和拟茎点霉属内生真菌，而抗氧化活性较好的菌株主要属于炭角菌属、孢菌属和毛壳属。
2.4郭建新等从银杏中共分离到522株内生真菌有302株对多种供试植物病原菌有不同程度的抑制菌效果，占总分离菌株数的57.85%，表明银杏内生真菌可以产生丰富的具有抑菌活性的次生代谢产物,可以作为对多种病原物具有抑菌活性物质筛选的资源。
四、球毛壳菌及其代谢产物生物活性研究
毛壳菌（Chaetomiumsp.）是从土壤中分离到的腐生菌,具有很强的纤维素分解能力,已发现有些毛壳菌（球毛壳C.globosum、卷毛壳C.cochliodes）对多种植物病原菌产生拮抗作用。
从植物体内分离到具有生防作用的内生毛壳菌（Chaetomiumsp.）或球毛壳菌。
球壳孢属（Sphaeropsis）菌丝体白色,菌丝纤细,分枝有隔;菌落上常生粉红色粘性物,器孢子单胞,有色,大,在10μm以上,卵圆形或长圆形。
球毛壳菌是分布最广泛的毛壳菌，其形态上因生境的不同往往在生长特性存在一定差异，但其子囊孢子形态稳定，不会因生境的不同而发生变化。
1、内生球毛壳菌发酵产物活性研究进展
1.1从美登木（Maytenushookeri）茎、叶中分离内生真菌,对其发酵产物经活性跟踪（抑菌实验）,分离筛选到一株球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）:
98M6,其产生抗癌化合物球毛壳甲素（chaetoglobosinA）。
1．2采用柱层析方法从银杏叶内生真菌ChaetomiumglobosumZY22的培养菌丝体提取物中分离得到共6个此生代谢物，其中球毛壳甲素对海虾表现出很强的毒性作用。
1．3筛选杜仲叶片的内生菌菌株No.173的总抗氧化活性最高,对菌株No.173进行了形态和分子鉴定。
菌株No.173rDNAITS扩增片段的碱基序列与球毛壳菌序列相似性为100%。
杜仲叶片中内生真菌菌株No.173为球毛壳菌,具有明显和稳定的抗氧化活性作用。
1．4杜仲内生球毛壳菌的发酵液提取物进行体外抗脂质过氧化和抑制小鼠红细胞溶血氧化的研究表明，抑制效果随着发酵提取物浓度的增加而不断增强，1mg/ml发酵提取物对小鼠心和脾两种组织脂质自发过氧化的抑制率分别为71.55%和71.68%，杜仲内生球毛壳菌发酵液提取物在体外有较显著的抗脂质过氧化作用和通过降低氧化溶血而保护红细胞的作用。
1．5对40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选．经形态学鉴定，cH08、CHl6、CHl7、CH23为球毛壳菌，CH21为角毛壳菌。
毛壳菌菌株发酵液抑茵作用显示，菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用；菌株CHl6、CHl7发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用；菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。
1．6从油菜（Brassicanapus）叶、根和种子上分离到的14株内生球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）对油菜菌核病原菌和立枯丝核菌均有不同程度的抑制作用,其中以种子上分离到的Dyst-1和MYNS-1的抑制作用最好。
Dyst-1和MYNS-1的发酵液通过高压湿热灭菌和细菌过滤器过滤灭菌后,分别对所选用的几株植物病原真菌表现出抑制作用,特别是对油菜种传病害菌核病病菌。
1．7从粗疣合叶苔中共分离纯化得到49株内生真菌。
毛壳属Chaetomium和Creosphaeria属为优势种群，就分离到的内生真菌进行发酵培养，能抑制稻瘟霉孢子萌发的菌株数为40株，进一步的抗真菌及体外抗肿瘤活性测试发现，粗疣合叶苔内生真菌能产生抗真菌和细胞毒活性物质。
1.8倪志伟等（2008）从云南美登木中获得了具有拮抗橙色青霉菌和结核分枝杆菌的球毛壳菌。
1.9内生真菌球毛壳ND35的生物安全性评价
植物内生真菌球毛壳（Chaetomiumglobosum）ND35抗生物质粗提物对植物生长性状和植物根际土壤微生物的影响,对小白鼠、大白兔的毒性,子囊孢子在水中的存活及对鱼类的安全性。
表明球毛壳菌ND35无毒、无污染,用于土传病害的生物防治无明显性风险。
五、对内生菌的研究存在的问题
（1）由于内生菌与宿主植物长期进化，与宿主植物形成了共生关系，因此，在内生菌的分离工作中，很多内生菌分离出来后，很快失活，无法进行下一步工作，并且很多内生菌的次生代谢产物，特别是未知的物质因为量少而很难被检测到；
（2）不可培养内生菌在内生菌多样性中占据了很大一部分，但到目前为止，研究比较多的均是可培养的内生菌的功能，对不可培养的内生茵功能的了解还很少；
（3）很多内生菌都有不同的生物活性，像促进植物生长、抗病害、抗逆等，但具体是由哪些化合物怎样配伍引起却还很少有具体报道；
（4）从植物内生菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物以创制新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物是未来研究重点之一，但大多数次级代谢产物产量并不很高；
（5）内生菌的保存目前分离到的内生菌以真菌居多,研究表明,内生真菌对储存条件的要求比一般真菌高,储存条件不合适时,会影响孢子的形成和所产生的活性物质的量。
而且在多次传代后,内生菌的生物学特性和生产性能容易发生退化。
因此,需要深入研究植物内生菌的生长特性和优化能够产生有价值化合物的培养条件。
（6）植物内生真菌产生与寄主相同或相似的生物活性物质的遗传机制。
（7）植物内生真菌产生有工业生产、医药价值的代谢产物的开发和利用。
（8）阐明产重要生物活性物质内生真菌中生物活性物质代谢途径；对其进行遗传改良和代谢调控；只有通过对植物内生菌全面系统的研究，并借助于其它学科的研究方法和手段。
才能推动植物内生菌研究的不断深入。
六、展望
可将内生菌的研究与药用植物的研究相结合,利用生物化学的方法对活性成分进行筛选,从而发现新的有价值的化合物。
对植物内生菌产生活性物质的研究,最终目的是用于开发有用药物,利用植物内生菌作为新药物来源,优势明显,潜力巨大。
植物内生真菌是个巨大的微生物新资源，具有重要的农药和医药应用潜力，必将在天然药物研究中得到开发和应用。
内生真菌在筛选活性物质方面表现出了巨大潜力,以内生真菌作为生产菌株来生产物活性物质有很多优点。
开发利用内生真菌资源,以获得产量高的适合生产或研究用的菌株;探索发酵条件,优化生产工艺,最终为活性物质产生菌实现产业化奠定基础。
每一种药用植物就是内生真菌的一个资源库,重视濒危药用植物内生真菌的研究,实现用内生真菌生产活性物质,是保护濒危药用植物的一个重要方面,具有重大的生态学意义。
结论：
分离自药用植物的内生真菌可以产生很多种生物活性物质,有些是与宿主相同或相似的生物活性物质,有些是新物质,具有特殊的生理功能。
银杏不同部位、时期所含内生真菌表现出丰富的多样性，是分离各种内生真菌的重要来源。
内生球毛壳菌发酵产物中含有多种具有不同生物活性的次生代谢产物，包括抗癌物质球毛壳甲素、抗氧化活性物质、抗菌活性物质以及细胞毒活性物质等丰富多样的生物活性物质，是值得研究多种药用活性成分的重要资源，有待进一步深入研究.
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