转换寄主对三叶草斑潜蝇生长发育.docx

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转换寄主对三叶草斑潜蝇生长发育

转换寄主对三叶草斑潜蝇生长发育

转换寄主对三叶草斑潜蝇生长发育、繁殖和体内消化酶的影响

摘要：

研究了三叶草斑潜蝇从菜豆分别转换至番茄和辣椒后的生长发育、产卵量以及主要消化酶活性的变化。

结果表明，寄主转换对三叶草斑潜蝇的发育历期、产卵量、蛹长、存活率有一定的不利影响，但在不同的转换寄主上影响程度存在对差异，在辣椒上的影响要大于番茄上的影响。

从菜豆转换到辣椒上的酶活性变化要大于番茄上的酶活变化，说明三叶草斑潜蝇对番茄的适应性要大于辣椒。

关键词：

三叶草斑潜蝇，寄主转换，生长发育、繁殖、消化酶

中图分类号：

S433

1.引言

三叶草斑潜蝇Liriomyzatrifolii（Burgess），英文名Americanserpentineleafminer，隶属于双翅目Diptera，潜蝇科Agromyzidae。

该虫原产于北美洲，主要分布于美国佛罗里达（Spencer,1973）。

1968年随菊花切枝出口开始向全世界迅速传播扩散；到1970年，北起加拿大安大略省，南至巴哈马、圭亚那和委内瑞拉等地均有三叶草斑潜蝇的记录；20世纪80年代末此虫在欧洲和地中海沿岸的30个国家或地区已有分布；此后又先后传入中国台湾、日本、印度、韩国等地区或国家。

如今三叶草斑潜蝇已经广泛分布于五大洲共70多个国家与地区（陈洪俊,2005）。

我国大陆地区于2005年12月首次于广东中山市发现三叶草斑潜蝇，随后此虫扩散迅速，2006年4月在海南海口市郊、澄迈、凌水、文昌和三亚又相继发现三叶草斑潜蝇的危害（汪兴鉴等,2006;王章根,2007）。

在许凤仙等人（2008）的调查中发现,三叶草斑潜蝇在杭州市的寄主植物已达到10科37种之多。

2008年8月30日,江苏丘陵地区镇江农业科学研究所在江苏句容郊外一块芹菜田发现几乎100%的芹菜叶被三叶草斑潜蝇危害（肖婷等，2009）。

陈洪俊等（2005）应用CLIMEX和GARP两种方法研究预测了三叶草斑潜蝇在中国的潜在分布区和高度适生区，结果表明：

黑龙江大部，吉林、辽宁、河北、北京、天津、山西、陕西、河南、安徽、江苏、浙江、湖北、重庆、贵州等省区市的全境，内蒙古西部、宁夏中南部、甘肃东部、四川东部和南部、云南大部、广西西部、湖南绝大部分地区、江西北部和福建北部和沿海地区地区均可适生；其中辽宁部分地区、山东东部、江苏北部、安徽北部、山西南部、陕西中南部、河南中部、湖北北部、甘肃东南部、四川东部、云南大部、贵州西部等地区为高度适生区。

雷仲仁等（2007）预测三叶草斑潜蝇主要分布于华南、华中、华东、西南等绝大部分地区，特别是以长江以南的广大地区,以及华北的山东、河北、天津和北京、东北的辽宁等部分地区，并在我国较北的地区（内蒙古、黑龙江）以及西部的新疆、西藏个别地点该虫也能适生，虽然这些地区的EI值较小，不是非常适宜该虫的定居，但这些地区的温室大棚可以为三叶草斑潜蝇发生为害提供环境。

三叶草斑潜蝇是典型的多食性昆虫，已记载的寄主有25科300多种植物；其中菊科、葫芦科和茄科植物及伞形科旱芹是其选择产卵和取食危害的嗜好寄主，其次为豆科、锦葵科、十字花科等。

重要寄主作物包括白菜、甜菜、辣椒、芹菜、菠菜、白菜、黄瓜、棉花、大蒜、韭菜、莴苣、洋葱、豌豆、红花菜豆、利马豆、菜豆、马铃薯、菠菜、番茄、豇豆、西瓜及其他瓜类、葫芦科蔬菜、紫苜蓿、菊花以及紫菀属、鬼针草属、大丽花属、石竹属、扶朗花属、丝石竹属、香豌豆属、旱金莲属、百日菊等植物和多种杂草（Spencer1982，肖良1994，汪兴鉴等2006〕。

在美国，芹菜、番茄、青椒等受三叶斑潜蝇危害较重。

由于该虫的危害，1981-1985年佛罗里达州的旱芹一度不能生产，损失达900万美元（Spencer,1982）；美国加利福尼亚州菊花生产每年平均要花1.48万美元/hm2的农药费防治此虫，还要减产23%，相当于这几年间共损失9300万美元（Parrella,1987）。

在台湾,主要危害花卉是非洲菊、菊花、大理花、满天星、桔梗、金孔雀等;主要危害的蔬菜是番茄、茄子、马铃薯、豌豆、甘蓝、白菜、茼蒿、胡瓜、花椰菜及辣椒等。

三叶斑潜蝇最初的危害对象是菊花、丝石竹、扶郎花等花卉,后逐渐转移到蔬菜上。

在南斯拉夫,该虫通过带虫的大丁草侵入,并开始取食番茄、黄瓜、芹菜和马铃薯幼苗。

荷兰花卉种植业生产与出口也曾遭受重大打击。

在印度有取食危害30余种作物和20余种杂草（陈洪俊，2005）。

经对广东省冬后蔬菜调查结果表明，三叶草斑潜蝇的寄主主要有菊科茼蒿、非洲菊，伞形科西芹、香芹，豆科豆角，葫芦科冬瓜，茄科番茄等；其中，茼蒿、芹菜、番茄等受害较重（刘春燕等,2007）。

三叶草斑潜蝇是种植业安全生产的严重威胁（Parrella,1987）。

土耳其温室中石竹被害率58.3%，室外菊花被害率达30%，印度番茄减产25%，蓖麻叶上虫道覆盖面积达60%；韩国樱桃番茄被害叶片率高达60%以上（陈洪俊等,2005）；在南非该虫被确认为第二大蔬菜害虫（管维等，2006）。

三叶草斑潜蝇一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个虫态。

雌性成虫用产卵器在叶片上刺孔，取食和产卵，被害部位表面开始时形成油渍状斑点,最后形成枯死斑点（Parrella,1987）。

卵产在叶表下，在寄主叶片和叶柄内潜食,形成不规则虫道（肖良，1994），是主要为害虫态。

4～7天后在土壤表层或叶面上化蛹。

成虫羽化24h后即可交尾产卵。

该虫每年可发生多代，部分地区达10代以上。

昆虫对寄主食物的适应性强弱对其种群的生存和发生有重要影响（康乐,1996;Hawthorne,1999）。

三叶草斑潜蝇在不同的寄主植物上的生物学特性存在差异，这会影响到后代种群的繁盛或衰退。

例如雌虫在旱芹上单雌产卵量，15℃时为25粒，30℃时约400粒；而在豌豆产卵量493粒，在菊花上达639粒（EPPO，2006）。

在美国一些州，由于美洲斑潜蝇和三叶草斑潜蝇对不同寄主植物适应性不同，在某些寄主植物上发生了种间替代现象（ZehnderandTrumble,1984;Parkmanetal.,1989）。

昆虫在寄主植物换茬、虫口密度过大，或传入新的地区时，往往会被强迫转换寄主。

研究结果表明，寄主转换对昆虫的生长发育速率和存活率存在一定的负面影响,但这种影响在不同的受体寄主上反应程度不一样。

例如，B型烟粉虱从番茄转接到GK22棉花上,其第1代的发育速率比第3代低21.5%,成活率低22.1%,而转接到S3棉花上,其第1代的发育速率比第3代仅低1.4%,成活率低15.6%。

说明不同受体寄主对烟粉虱转换寄主后生长发育速率的恢复也有一定的影响（周福才等，2006）。

将马尾松毛虫从马尾松转换移到湿地松上取食也发现对其生长发育与繁殖是不利的（梁玉勇等，2008）。

昆虫在一种寄主植物上长期取食后，便获得了与之相适应的消化酶，并形成了相对稳定的代谢途径，如果寄主植物发生改变，其代谢途径也必然随之发生相应的改变，从而对生长发育产生影响（周福才等,2006）。

张桂芬等人（2008）研究了寄主植物转换对B型烟粉虱和温室粉虱淀粉酶及蛋白酶活性的影响，结果发现植物种类的改变对B型烟粉虱的蛋白酶活性没有显著影响,而温室粉虱却受到明显抑制,说明B型烟粉虱对寄主植物的利用效率比较高,应对植物种类转换的能力较温室粉虱强，这可能也是导致番茄和棉花上B型烟粉虱成虫寿命比温室粉虱长、繁殖能力比温室粉虱强的主要原因之一。

三叶草斑潜蝇成虫飞翔能力有限，幼虫潜叶危害，主动扩散能力弱，在入侵扩散过程中容易遇到寄主转换。

但目前关于三叶草斑潜蝇和寄主植物关系的研究多集中于寄主植物种类及危害程度的调查，寄主植物对三叶草斑潜蝇发育历期、繁殖能力等生物学特性的研究（刘春燕等，2007），寄主转换对三叶草斑潜蝇生长发育以及生理代谢的影响还不太清楚。

因此，我们以三叶草斑潜蝇为对象，在前期试验的基础上，以辣椒和番茄为转换寄主，研究了转换寄主后三叶草斑潜蝇生长发育、繁殖等特性以及2种消化酶的活性，研究结果对揭示三叶草斑潜蝇的入侵扩散机制具有一定意义。

2.材料与方法

2.1实验材料

（1）供试昆虫：

试验中使用的三叶草斑潜蝇来自实验室长期维持的种群。

寄主植物为菜豆（天马地豆）。

采集三叶草斑潜蝇蛹，单头放于指形管中，用脱脂棉封口保持湿度，并防止成虫羽化后逃逸，随后将指形管放在人工气候箱中，成虫羽化后用于试验。

（2）供试植物的栽培：

试验中用到的寄主植物分别为菜豆（天马地豆）、番茄（浙杂809）和辣椒（吉林×鸡爪）。

挑选健康、饱满的植物种子进行催芽，然后播种于混合土中（土：

蛭石：

草木灰=1:

1:

1），并置于室内（25±1℃）阳光充足处生长。

待菜豆长至2片叶，辣椒、番茄长出4～5片真叶单株移植到营养液中用于实验。

试验中所用的营养液为Hoagland水培营养液。

（3）主要试剂：

石碳酸、乳酸、甘油、酸性品红、葡萄糖、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白。

磷酸缓冲液、3,5-二硝基水杨酸、麦芽糖、酪氨酸、碳酸钠、Folin-酚试剂等。

（5）所需仪器：

人工气候箱、超低温冷冻机、冷冻离心机、酶标仪、解剖镜等。

2.2实验方法

2.2.1寄主转换对三叶草斑潜蝇生长发育的影响

将单株番茄植株放在人工气候箱（25±1℃）内的养虫笼（30cm×30cm×30cm）中，每笼接入10对（♀：

♂=1:

1）成虫，48h后驱除成虫，每24h观察1次卵的孵化情况，并对孵化的幼虫进行标记，为防止虫口密度过大造成种内竞争，保持每cm2叶片上的幼虫数≤1个，多余的幼虫用解剖针扎死。

标记完成后将植株放回人工气候箱，每24h观察1次幼虫的生长发育情况。

化蛹前摘下叶片用湿棉球包裹叶柄，放在培养皿中待化蛹。

化蛹后在显微镜下用测微尺测量蛹的长度。

随后将蛹单头放置在指形管中观察羽化情况。

计算各虫态发育历期和存活率。

至少观察50头从卵到成虫的三叶草斑潜蝇。

辣椒上的寄主转换试验和番茄上的试验同时进行，方法相同。

以未经过寄主转换，直接在菜豆上的处理为对照。

2.2.2寄主转换对三叶草斑潜蝇取食和产卵量的影响

将单株番茄植株放在人工气候箱（25±1℃）内的养虫笼（30cm×30cm×30cm）中，每笼接入10对（♀：

♂=1:

1）成虫，48h后驱除成虫。

测量叶片面积，通过Parrela和Robb的染色方法调查取食斑和产卵量（采用Parrela和Robb的染色方法），以上处理重复3次。

Parrela和Robb的染色方法：

（1）50ml蒸馏水，50ml石炭酸，50ml乳酸和100ml甘油，加入0.25g的酸性品红，搅匀配制成染色液。

（2）染色方法：

取一个培养皿，倒入20ml染色液置于电炉上加热，切忌染色液煮沸溢出。

加入完整叶片浸没煮至熟透（4~8s），后将染色液从电炉上移开，冷去后倒掉染色液，用蒸馏水冲洗数遍至无染色液残留。

整个过程勿使叶片皱褶而影响染色效果。

（3）镜检：

将处理过的叶片放于培养皿中，在解剖镜下检查。

被染成黑色的斑点即为三叶草斑潜蝇的卵，而取食孔为环状斑，中央色浅。

2.2.3寄主转换对三叶草斑潜蝇体内淀粉酶酶活性的影响

（1）供试昆虫的处理

取刚羽化三叶草斑潜蝇成虫用微虫笼接在辣椒和番茄叶片上，每笼5-10头，接虫2h、4h、8h、16h、32h后取出，各种时间段各收集10只成虫，液氮冷冻后放于-70℃保存备用。

以未经过处理的三叶草斑潜蝇为对照。

（2）酶液的制备

淀粉酶酶液的制备：

将单头试虫置于预冷的载玻片上并滴加10μL磷酸缓冲液（PBS，0.04M，pH7.0），快速碾磨后将匀浆液移入0.2mLPCR管中，然后以20μLPBS缓冲液冲洗匀浆装置并与上述匀浆液混匀，4℃10000rpm离心5min，吸取上清液立即进行淀粉酶活性测定。

蛋白酶酶液制备中所用的PBS缓冲液浓度为0.2M，pH值为6.0，其他具体步骤同上。

（3）淀粉酶酶活的测定

①标准曲线的制作

取1.0mg/mL的麦芽糖标准溶液稀释至0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL。

取上述各浓度溶液和3,5-二硝基水杨酸试剂各10μL混匀，沸水浴中加热5min，随后放在冰上冷却，待冷却后加入蒸馏水80μL，混匀。

取混合液90μL移入酶标板中，立即于490nm处读取OD值，并确定OD值与麦芽糖含量之间的对应关系。

②淀粉酶酶活的测定

以1%的淀粉溶液5μL为底物，加入5μL待测液混匀，25℃下温浴3min后加入3,5-二硝基水杨酸试剂10μL终止反应，混匀并短暂离心。

其它操作步骤及OD值测定方法与标准曲线相同。

根据标准曲线计算酶活力。

淀粉酶活性以μg（麦芽糖）/mg（单头三叶草斑潜蝇蛋白含量）/min表示。

2.2.4寄主转换对三叶草斑潜蝇体内蛋白酶酶活性的影响

①标准曲线的制作

取1.0mg/mL的酪氨酸标准溶液分别稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL。

分别取上述各浓度溶液20μL，加入0.55M碳酸钠100μL和Folin-酚试剂20μL后混匀，将上诉混合液移入酶标板中，37︒C温浴15min后立即于680nm处读取OD值，并确定OD值与酪氨酸含量之间的对应关系。

②蛋白酶酶活的测定

在20μL待测液中加入0.5%的酪蛋白溶液50μL，混匀后37℃温浴15min，加入10%三氯乙酸50μL，混匀，4℃10000rpm离心15min。

取上清液20μL至酶标板中，其他操作步骤及OD值测定方法与标准曲线相同。

根据标准曲线计算酶活力。

蛋白酶活性以μg（酪氨酸）/mg（单头三叶草斑潜蝇蛋白含量）/min表示。

2.2.5三叶草斑潜蝇蛋白浓度测定

采用牛血清白蛋白为标准的考马斯亮蓝方法测定相关三叶草斑潜蝇的蛋白浓度。

3.数据处理与分析

采用单因素方差分析（One-WayANOVA：

LSDtest，SPSS10.0）寄主转换后酶活性之间是否存在显著差异。

4.结果与分析

4.1寄主转换对三叶草斑潜蝇生长发育和繁殖的影响

从图1可知，三叶草斑潜蝇从菜豆转换到番茄和辣椒上后各虫态的发育历期都有一定的延长。

一直在菜豆（对照）上饲养的三叶草斑潜蝇卵、幼虫、蛹以及从卵到成虫的历期分别为2.9、3.9、8.7、15.5d，显著短于在番茄和辣椒上的发育历期。

转换寄主对三叶草斑潜蝇的存活率也有显著影响。

三叶草斑潜蝇在菜豆上的存活率最高，约92%，转换寄主后在辣椒上的存活率下降到67.7%，番茄上的存活率约为75%。

辣椒（1.5mm）和番茄（1.6mm）上的蛹长也显著低于菜豆（1.8mm）。

寄主转换后，三叶草斑潜蝇在番茄和辣椒上的取食要显著少于菜豆。

一直饲养在菜豆上的三叶草斑潜蝇取食斑的数量为4.0个/cm2，但辣椒和番茄上的取食斑仅有1.0～1.4个/cm2，辣椒和番茄上的取食斑数量没有显著差异。

寄主转换后，三叶草斑潜蝇在辣椒上的产卵量也显著降低，仅有0.2粒/cm2，在番茄上的产卵量没有显著变化，与对照相同，均为0.3粒/cm2。

图1三叶草斑潜蝇在不同寄主植物上的生长发育历期

Figure1EffectsofindifferenthostshiftsondevelopmentofLiriomyzatrifolii

图2三叶草斑潜蝇在不同寄主植物上的存活率（A）和蛹长（B）

Figure2Effectsofindifferenthostshiftsonsurvival（A）andPupalong（（B）ofLiriomyzatrifolii

AaA

B

图3三叶草斑潜蝇在不同寄主植物上的取食斑（A）和产卵量（B）

Figure3Effectsofindifferenthostshiftsonfeedingspot（A）andspawningquantity（（B）ofLiriomyzatrifolii

4.2寄主转换对三叶草斑潜蝇体内淀粉酶活性的影响

由图4可知，改变寄主植物种类后，三叶草斑潜蝇在经历不同的寄主植物转换后体内淀粉酶活性变化有所不同。

三叶草斑潜蝇从菜豆转换到番茄上后体内的淀粉酶活性略有升高，但与菜豆（对照）相比没有显著差异。

转换到辣椒上后，在8h内淀粉酶活性变化幅度不大，但与对照相比明显处于激活状态。

8h后，取食辣椒的三叶草斑潜蝇体内淀粉酶活性开始下降，但仍显著高于对照和番茄上的处理。

1

图4寄主转换后三叶草斑潜蝇体内淀粉酶活性变化

Figure4ThechangesofamylaseenzymeactivityofLiriomyzatrifoliiwithhostshifts

4.3寄主转换对三叶草斑潜蝇体内蛋白酶活性的影响

由图5可知，经过寄主转换，三叶草斑潜蝇体内蛋白酶变化比较剧烈，与对照相比存在显著差异。

在16h内番茄处理上的蛋白酶活性显著低于对照，随后蛋白酶活性上升超过对照。

在辣椒处理上，蛋白酶活性呈现出现上升后下降，然后慢慢趋于平稳的变化趋势，在2～16h内，辣椒处理上的三叶草斑潜蝇蛋白酶活性显著低于番茄，在32h时两个处理上三叶草斑潜蝇的蛋白酶活性没有显著差异。

Figure5ThechangesofproteaseenzymeactivityofLiriomyzatrifoliiwithhostshifts

5.讨论

昆虫的生长发育、繁殖以及生理代谢与寄主植物密切相关。

本研究表明，三叶草斑潜蝇从菜豆分别转换到辣椒和番茄后发育历期延长，存活率、蛹长、取食斑数量也有所下降。

但转换到番茄上对产卵量没有影响，转换到辣椒上产卵量会显著下降。

说明寄主转换对三叶草斑潜蝇的发育历期、产卵量、蛹长、存活率有一定的不利影响，但在不同的转换寄主上影响程度存在对差异，在辣椒上的影响要大于番茄上的影响。

对寄主转换后三叶草斑潜蝇体内蛋白酶和淀粉酶活性的测定结果表明，从菜豆转换到辣椒上的酶活性变化要大于番茄上的酶活变化，说明三叶草斑潜蝇对番茄的适应性要大于辣椒（郑丹，2009），而我们在寄主转换对三叶草斑潜蝇的生物学特性进行的研究也发现，从菜豆转换至辣椒上后出现了存活率低降低，蛹长度偏小，且产卵量显著下降等情况。

推测可能是由于三叶草斑潜蝇从菜豆转换到辣椒上饲养，其体内的淀粉酶活性随着时间的增长而下降，导致从寄主植物叶片中摄取的物质不能正常的转化为其可利用的营养成分，提供的能量低于三叶草斑潜蝇正常生长发育的需求，所以其在辣椒上的存活率、产卵量等较低。

转换寄主后仍有一定数量的三叶草斑潜蝇能够完成1个世代的发育过程。

这在三叶草斑潜蝇被迫进行寄主转换时对其种群的维持有着重要作用。

且周福才等（2006）发现，不同受体寄主对烟粉虱转换寄主后生长发育速率的恢复也有一定的影响，在转换寄主上生活2-3代，各种生物学特性即可达到稳定，三叶草斑潜蝇是否也存在相似情况还需要深入研究。

这对三叶草斑潜蝇进行准确预测预报有重要作用。