实时荧光定量PCR技术及其应用.docx

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实时荧光定量PCR技术及其应用

实时荧光定量PCR技术及其应用

摘要:

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。

文章对实时荧光定量PCR的原理、主要类型、优点、影响因素及应用等进行了综述。

关键词:

实时荧光定量PCR类型优点影响因素应用

实时荧光定量PCR技术（real-timefluores-cencequantitativePCR,RTFQPCR是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新技术,它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

[1]目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。

1实时荧光定量PCR技术的原理

实时荧光定量PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。

荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子的激发光谱重叠时,供体荧光分子自身的荧光强度衰减,受体荧光分子的荧光强度增强。

Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

Ct值是实时荧光PCR中一个很关键的因素,C代表循环（Cycle,t代表阈值（Threshold。

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。

因此,根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系,只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

与普通PCR相比,实时荧光定量PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化,可以对初始模板量进行定量分析。

简单地说,实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。

2实时荧光定量PCR技术的主要类型

荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。

荧光染料以SYBRGreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。

荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。

2.1SYBRGreenⅠ

SYBRGreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。

在游离状态下,SYBRGreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。

因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[3]。

其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。

SYBRGreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。

但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。

2.2TaqMan探针

TaqMan探针技术是有美国PerkinElmer（PE公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。

当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。

但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。

由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[4]。

TaqMan探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。

但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[5]。

2.3分子信标

分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8bp。

在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。

当溶液中的模板与分子信标

结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。

与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。

分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。

其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[6]。

3荧光定量PCR与常规PCR的比较

荧光定量PCR是将荧光技术应用于PCR,即使用荧光染料或荧光标记的探针,与PCR过程中的扩增产物结合,在PCR的每一次循环中,都可观察到荧光强度的变化,这种变化对应于扩增产物量的增加,通过绘制标准曲线,最终可得到反应初期的靶基因数量。

荧光定量PCR用特定的仪器将PCR的扩增、检测和结果分析结合在一起,实现了真正意义上的实时绝对定量,相比于常规PCR具有许多优点。

3.1实时测定,节约时间

常规RT-PCR在PCR反应后,常需要使用凝胶电泳其染色（EB为致癌物质、DNA测序、Southernblot等方法对结果进行人工或自动化定量,这些后续步骤不仅使测定时间变长,而且在样品的传递过程中还增加了污染的机会,而荧光定量PCR不需要扩增后的这些处理就可直接对待测样本实时定量同时,从逆转录开始到完整定量结束的整个过程都可实现自动化,这极大地节约了时间和劳动量。

3.2重复性好,测定偏差小

PCR的重复性可用循环阈值来衡量,在荧光定量PCR过程中,连续不断地监测反映体系中荧光信号的变化,当信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值时,此时的循环次数即为循环阈值。

荧光定量PCR循环阈值的变异系数在2%以下,而常规RT-PCR变异系数多在14%左右,毫无疑问,实时逆转录PCR比常规PCR的测定偏差明显减小。

3.3灵敏度高,特异性好

常规PCR有时为提高灵敏度,常需要进行二次扩增,但这同时也降低了特异性,增加了污染的可能性和假阳性错误。

而对于荧光定量PCR,其高灵敏度不需要进行二次扩增,这将减少假阳性机率。

因此,荧光定量PCR在提高反应灵敏度的同时,也保证了其特异性。

4影响实时荧光定量PCR试验结果的因素

从DNA出发进行定量相对比较简单,一般在保证引物及探针的特异性、PCR反应体系的合理性以及DNA模板的纯度和完整性的情况下,可以保证试验的顺利进行。

从RNA出发对

mRNA进行定量时,操作比较复杂,影响试验结果的因素也比较多。

4.1RNA的完整性

因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量,所得的结果也是错误的。

所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范,避免RNA酶的污染[7-8]。

4.2RNA样品中的基因组DNA污染

提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。

基因组DNA对试验有两个影响:

一是影响对RNA的精确定量;二是影响PCR扩增的特异性。

4.3PCR反应体系的优化

PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物,为此,首先要保证PCR反应体系达到最优。

目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒,可以方便PCR反应的操作。

4.4反转录

反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量,反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。

目前常用的反转录酶有2种:

AMV-RT和MMLV-R。

反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。

相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR[9]。

4.5利用实时定量PCR

研究基因表达时,一般用相对定量的方法相对定量必须用到内标基因。

可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。

常用的内标基因有β-tublin、actin、GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等[10]。

尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定,但是最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。

也就是说并不是任何内标基因都适合任何试验。

在选择内标基因时,应仔细考虑各种因素,选择合适的内标基因或内标基因组合。

5实时荧光定量PCR方法的应用

实时荧光定量PCR技术已经广泛地应用于基因表达的定量（细胞因子、生长因子、转录因子等和等位基因的鉴定（单核苷酸多态性的检测等分子生物学基础研究领域[11]。

同时,由于其能够快速、简便地扩增微量DNA序列,且特异性好、灵敏度高和操作简单等特点,被广泛地用于各种病原体的检测（病毒、细菌、真菌、寄生虫等的检测监控以及定量分析。

5.1植物病害检验检疫

实时荧光PCR技术由于其高特异性和灵敏性的特点,目前被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方式,已经成为植物病害诊断中新的可靠方法[12]。

甚至一些尚不能得到纯培养的病原菌可以实时荧光定量方法检测出来,并且通过内参基因和定量样品的处理可以对其在植物组织中的菌量进行定量检测[13]。

王中康[14]等已经建立了柑桔难培养韧皮杆菌的实施荧光检测方法,利用该方法不仅可以定性、定量检测出不同组织中柑桔黄龙病菌,还对病菌在其传播媒介昆虫-柑桔木虱体内的循环进行了深入研究[15]。

P.Kogovsek[16]通过荧光RT-PCR快速检测出PVYNTN之间潜在的块茎坏死和标准PVYN分离菌株,该方法还可以探测到PVYO株系,敏感性高于ELISA法7个数量级。

在出入境检验检疫中,实时荧光定量检测由于其高灵敏度和快速可靠操作简便的特点而成为首选检验方法。

刘红光等[17]利用荧光定量的方法检测了柑橘衰退病,其检测灵敏度较常规PCR提高了100倍;郭京泽等[18]根据辣椒轻斑驳病毒衣壳蛋白区域编码序列,设计了辣椒轻斑驳病毒的特异TaqMan荧光探针,检测结果只有感染辣椒轻斑驳病毒的样本进行荧光PCR检测呈阳性,而烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒的荧光PCR检测都呈阴性,所建立辣椒轻斑驳病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,是DAS-ELISA法的100倍;李博等[19]依据萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种的16S~23SrRNA间隔区ITS序列,设计引物CfbF/CfbR.PCR扩增3个糖甜菜叶斑菌及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191bp产物。

已经有大量检疫性植物病害有了规范化的实时荧光检测方法,而荧光检测的高灵敏度使其可以进行无症带菌样品的检测,为重大疫害生物的非疫区建设提供了保障,保证了植物生产安全。

5.2医学和动物检疫

动物检疫对畜牧业的发展至关重要,而且一些动物病害还直接威胁着人体的健康。

近年来,疯牛病、绵羊痒病已被证实与人的克雅氏病有直接关系。

因此,国际上严格禁用肉骨粉作所有牲畜的饲料用途,动物源性食品、某些日用消费品的安全性也受到关注。

荧光定量PCR在动物检疫方面的应用之一是对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分进行检测,它可使检测变得更加简便和准确。

实时荧光PCR更主要的应用方向是医学和动物病害的检测和鉴定。

空肠弯曲菌是人类主要的食源性病原之一,常规细菌培养鉴定结果不可靠。

阳成波等[20]先后建立基于TaqMan探针R和SYBRGreenI的荧光定量方法来检测空肠弯曲菌,检测限度为5cfu,整个检测过程在60min内完成。

张鹤晓等[21]根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物和探针,在循环参数、病毒核酸的提取方法、反转录条件的基础上,建立了快速的通用型“一步法”检测所有A型流感病毒的通用型荧光RT-PCR。

宋志军等[22]建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒

（PRRSVTaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度可达5.0拷贝。

杨素等[23]应用荧光RT-PCR技术,利用口蹄疫病毒的5’端UTR区的IRES片段设计和合成了可检测7个血清型口蹄疫病毒群特异性引物和Taqman探针,结果表明:

该方法敏感性高、特异性强,克服了传统的病毒分离鉴定方法耗时长，敏感性和准确性较差,而且容易造成病毒扩散及环境污染的缺点,适用于大批量样品的快速检测。

5.3环境微生物检测环境中存在着多种多样的致病微生物,它们与许多传染性疾病的传播和流行密切相关。

因此,定期检测环境中致病微生物的动态（种类、数量、变化趋势等具有重要的实际意义。

传统检测方法是对病原体进行人工培养或细胞培养,或是对无法培养的病原体进行显微镜检测,这些方法不仅耗费大量的人力、物力和财力,而且准确度差。

采用荧光定量PCR技术检测环境中的微生物病原体,无需培养而是直接取样进行分析,特异性强、灵敏度高、快速简便且具有较高的精确度。

Brooks[24]等对雨季时海水中的甲肝病毒,采用该技术进行了检测及定量分析。

结果表明,该技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度。

同时指出了PCR技术对环境微生物定量测定的发展前景。

Rebecca[25]等采用FQ-PCR对容易引起水传播疾病的贾第虫和隐孢子虫进行了定量检测分析,建立了定量分析方法。

5.4转基因检测PCR技术是检测转基因最方便快捷的方法。

因此,基于转基因产品中特异DNA片段的荧光定量PCR筛选鉴定方法已被一些国家作为农产品及其加工食品中转基因成分的标准检测方法。

其检测的原理主要是利用RTQ-PCR检测选择标记、启动基因以及转入的靶基因。

栾凤侠[26]等针对转基因小麦品系中通用的启动子、终止子以及标记基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为内源特异参照基因,绘制内源基因和外源基因的标准曲线,建立了转基因小麦的RTQ-PCR检测方法。

陈红运[27]等根据已商品化的转基因植物品系的基本信息,选择了CaMV35S启动子,FMV35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ、pac和bar作为目标基因,设计特异引物和TaqMan荧光探针检测转基因植物产品,包括转基因玉米、转基因大豆、转基因油菜籽和转基因马铃薯。

李葱葱等[28]根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的RTQ-PCR方法。

应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以用于检测转基因成分,而且可以用于鉴定转基因品系。

Tesson[29]等确定了实时荧光定量PCR的技术条件,利用2种发光探针及适当的循环阈值,扩增1个转移后的基因和1个对照基因,以分析转基因鼠的基因接合性,结果表明:

同型结合和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔

遗传规律,该方法为转基因动物的同型结合及异质接合研究提供了可靠方法,在转基因动物繁育及基因剂量功能效应研究中具有广泛用途。

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