胶体电泳分析DNA片段.docx

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胶体电泳分析DNA片段

膠體電泳分析DNA片段

國立中興大學植物病理系張碧芳助理教授

前言

核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性，於電場中會穿過膠體，如：

agarose或polyacrylamide膠體，而朝向正極移動。

因為不同分子量的核酸，在膠體孔徑中移動的速度會有差異，藉此將不同大小的核酸分開。

Agarose膠體為較普遍用為電泳的材料，主要因為其製備方便及簡單，常使用在200bp~50kb核酸片段間的分析，且通常以水平式電泳槽來進行電泳。

然而，polyacrylamide膠體的製備相較於agarose膠體則較為麻煩，且未聚合前之acrylamide具有神經毒性，可經由皮膚或黏膜吸收，在操作上更應小心。

Polyacrylamide膠體電泳可有效分析小分子量的核酸片段，甚至小至1bp，如：

核酸定序，一般以垂直式電泳槽來進行。

膠體電泳的解析力

膠體電泳可分析小至數個核苷酸，大至百萬個核苷酸的染色體DNA，但它也有一定範圍的解析力，並不是一片膠體就可分析各種大小的DNA片段，故要得到好的解析力，必須要探討膠體電泳的解析範圍。

常用於分析DNA的膠體電泳有兩種，一種是洋菜凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，簡稱AGE），另一種為聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）。

這兩種凝膠，由於其濃度不同時，所形成之凝膠體的孔洞不同，故其解析範圍不同。

對直線形DNA的有效分析範圍，洋菜膠常用0.3%至2.0%之濃度，可分析於1~60kb（kilo-basepairs或kilo-base）DNA分子（見表一），而聚丙烯醯胺凝膠常用濃度為2.5%至20%，可分析1~1000base或base-pair（bp）長度之DNA（表二）。

（資料來源：

曾等，1987）

（資料來源：

曾等，1987）

洋菜凝膠的製備非常簡單，又沒有丙烯醯胺的毒性，故為最常用的膠體，但AGE只適合於分析較大片段的DNA，故在1kb左右或更小的DNA片段，就只好用較不易操作的PAGE。

有時為了增加1kb左右DNA的解析範圍，也有使用洋菜凝膠與聚丙烯醯胺凝膠混合膠體作電泳，但其操作更麻煩，而且會因凝聚情況不同而得到誤差的結果。

為了方便分析1kb以下的DNA片段，1980年代美國FMC公司製產一種洋菜凝膠，稱為NuSieveagarose，它可配製成1~9%之凝膠，以分析較小片段之DNA分子，其解析力極佳，依不同的凝膠濃度而有不同之解析範圍（見圖一及圖二），但所使用的電泳緩衝液種類也會影響凝膠之解析範圍（見圖一A、B及圖二A、B之比較）。

一般常用之電泳緩衝液有三種，其配方如表三，其中以TAE及TBE最常用。

選用TAE或TBE緩衝液，對大多數電泳結果，並不造成太大的差異，但某些樣品的分析，有時卻有極大的差異，

（資料來源：

曾等，1987）

（資料來源：

曾等，1987）

（資料來源：

曾等，1987）

前述用NuSieve膠體電泳，只是DNA泳動距離（或稱速度）之差異而已，對所得結果之判讀，還不會造成誤差。

不過，如果想把AGE分離之DNA片段回收再分析，則必須選用TAE進行電泳，否則對DNA回收率有影響，相反的，分析單股DNA時，卻常選用TBE。

電泳技術使用至為方便而可靠，但在分析DNA分子上，一直無法達到分析較大分子的染色體DNA，因此，多年以來，進行基因在染色體上定位的研究，完全依賴遺傳分析或配合顯微鏡的定位分析。

最近幾年，由於對電泳電場的試驗分析，已經開發可以用AGE作為分析大於100kbDNA分子。

以酵母菌染色體DNA所作分析結果，酵母菌內其中16條染色體之DNA大小在200kb至1500kb間，經由改變電場中電極於某一角度下交互轉換通電之結果，可以達到分離多數染色體DNA的目的，這些設計，包括一種稱為OFAGE（orthogonal-field-alternationgelelectrophoresis），其設計主要是電極以（90∘）直角交互對換通電。

另一種稱為FIGE（field-inversiongelelectrophoresis），為定期將電極作180∘轉換，其方式如向前電泳2秒鐘，向後電泳1秒鐘之交換進行。

而最好的設計，目前以CHEF（contourclampedhomogeneouselectricfields）電泳，可得到最好的解析力，其設計主要為一六角形之電泳槽之六邊上，圍繞上電極，以120∘角度交互作電泳。

上述這三類之電泳設計，即為一般所稱之脈衝電泳（pulsedfieldgelelectrophoresis），而電泳中之脈衝交互通電之角度以120度之解析力似乎最好。

影響電泳的因素

核酸在電泳時，其移動速率與分子量大小成對數反比，而與核酸序列的組成鹼基無關。

其他影響電泳的因素有：

（一）膠體濃度：

濃度之高低，與膠體之孔徑大小有關。

濃度高，孔徑小，適合小分子量的核酸電泳；而濃度低，孔徑大，適合大分子量的核酸電泳。

一般agarose的濃度為0.3~2.0%，適合分析100~60,000bp大小之核酸；polyacrylamide之濃度則為3.5~20.0%，適合分析6~3,000bp大小之核酸。

（二）核酸結構：

不同形狀之同種DNA，在相同條件電泳，其移動速率會有所差異，如：

超螺旋DNA（supercoil）、缺口性環型DNA（nickedcircular）及直線型DNA（linear）等三種型態一同電泳時，超螺旋DNA移動速率最快，其次為直線型DNA，缺口性環型DNA速率最緩慢。

（三）電泳緩衝液之鹽類成分：

緩衝液之鹽離子濃度會影響核酸電泳結果，在高鹽離子濃度下，對電泳液pH值的緩衝能力佳，但因為在固定電壓下會使電流傳導增強，致產生過熱的情況，甚至其熱度可使膠體融熔；在低鹽離子濃度下，則電流傳導不易，致核酸不易移動。

電泳緩衝液依其所含鹽類不同，可分為三類（如表三）：

Tris-acetate（TAE）、Tris-borate（TBE）和Tris-phospdate（TPE）。

TAE含40~50mMTris-acetate，當電泳時，acetate會被氧化成碳酸鹽，造成陽極pH值上升，陰極pH值下降，使得緩衝能力逐漸消失，所以長時間以TAE電泳，必須更換緩衝液。

TBE含89~90mMTris-borate，是目前常用的緩衝液，其緩衝能力良好，可經長時間電泳。

Agarose膠體電泳通常使用0.5×TBE；polyacrylamide膠體電泳則使用1×TPE。

TPE含50mMTris-phosphate，經長時間電泳，緩衝能力會降低，必須更換緩衝液，且其不適於利用酒精沉澱自膠體中回收核酸，因為磷酸鹽亦會被沉澱下來。

電泳結果的觀察

核酸電泳後，膠體中的核酸可經ethidiumbromide（EtBr）染色，EtBr會嵌入核酸鹼基中，以紫外線照射，則核酸吸收紫外線波長的光線，再經EtBr放出可見波長的光線，藉以觀察核酸之位置。

EtBr染色之濃度為0.5μg/ml。

除了在電泳後，再將膠體浸染於EtBr溶液外，亦可在製備膠體時，直接將EtBr加入膠體內，使核酸在電泳進行中被染色，以節省電泳後，需要染色的時間，但經EtBr嵌合的核酸，其電泳速率會降低，如：

直線型核酸，約降低15%的移動速率。

實驗流程

DNAGel之配法

1.0.5×TAEbuffer（緩衝液）之配法：

原液（50×）稀釋100倍，即取30ml50×的TAEbuffer加水到3000ml。

2.如：

1%Gel：

取0.5×TAEbuffer40ml+0.4gagarose（先加agarose再把buffer倒下，順便沖一下留在瓶壁上的agarose）。

第1、4、7組用0.8%gel（0.32g/40ml）；第2、5、8組用1.2%gel（0.48g/40ml）；第3、6、9組用1.5%gel（0.6g/40ml）。

3.放入微波爐中加熱到完全溶解（約40秒（25ml）至2分鐘（150ml），視情況而定）。

先用40秒煮一次，再以每次10~25秒依次煮至沸騰，至少要沸騰3~5秒才可以，但不可太久，否則體積會減少，因為溶液的水會蒸發掉。

由微波爐取出agarose溶液，應等待10~20秒後，再輕搖三角瓶以混合均勻，以防熱溶液突沸燙手。

4.待已溶之agarose降溫至60℃左右（以手握三角瓶底不燙手即可），即可倒入製膠模型中，若有氣泡，可以吸管尖挑開，之後架上齒梳，待其冷卻，凝膠後（即gel由透明變成白色半透明果凍狀即可），輕輕將齒梳向上拉開（注意要慢慢拉開，否則要加DNA樣品的孔洞會破掉喔！

），即可進行電泳分析。

註：

50×TAEbuffer之成分：

2MTris-acetate，0.05MEDTA，其配法如下：

秤取242gTrisbase，於500mlRO水中攪拌至溶解，再加57.1ml冰醋酸（glacialaceticacid）及100ml0.5MEDTA（已將pH調至8.0），最後以RO水補足至總體積1公升。

DNAagarosegel（洋菜膠體）電泳法

1.將已配好之agarose凝膠（gel）由製膠模取出，注意不使膠體滑落，以衛生紙將膠模左右及下方之多餘凝膠擦掉，將膠體連同膠模一起放入電泳槽中，緩緩加入300ml之0.5×TAE緩衝液，直到緩衝液蓋過gel上之孔洞（well）即可，注意gel的放置位子應將孔洞朝電極負極處（即靠近電源開關那邊）。

2.將DNA樣品（各8μl）加入1/5體積（2μl）的6×Gelloadingbuffer（內含0.25%bromophenolblue及30%甘油溶於水中），以微量吸管混勻，分別加入gel上之各孔洞中。

以12孔洞之50mlgel而言，每孔洞可加入（loading）最多30μl體積的DNA樣品（已加loadingbuffer後之體積）而不外溢，注意勿以微量吸管尖端刺破孔洞底部之gel，否則樣品會漏掉；另外要加入樣品時以微量吸管吸取混勻的DNA樣品，並避免吸入氣泡，若吸入氣泡，則在loading樣品時會使樣品溢出孔外而流失。

3.每片gel的最左及最右2孔分別加入DNA片段長度（basepair）標準液（100bpmarker）各10μl（原marker之4倍稀釋液），中間10孔分別加入待測之DNA樣品（總體積10μl），最後以50伏特進行電泳分析，約45分鐘後，可見藍色染劑已由原先洞口泳動至gel底部（電極正極處），此時可關電源，並將gel取出，進行EtBr染色。

4.註：

DNA因含磷酸根，故帶負電，在電場中會往正極移動。

Gel染色法

（本步驟較危險，由助教操作之）

註：

gel染色過程，必須全程戴手套，因EtBr為致癌劑，其會嵌入雙股DNA中，造成細胞突變，故染色後的gel也不可以隨意丟棄，請同學務必注意！

1.將電泳後之DNAgel放入100mlEtBr溶液（0.25μg/ml）中染色，並將染色盒置於震盪台上，使其染色較均勻，染色15~20分鐘。

2.將gel放入退染盒中（內含RO水）置於震盪台上退染10分鐘。

3.將gel移至UV燈台上，旁邊放置一把螢光尺，使刻度”0cm”處對準gel的孔洞處（螢光尺與gel距離約1cm），以「膠體照相系統」於暗箱內進行數位照相。

拍照完應馬上關UV燈，而且操作時一定要戴UV防護罩，以免眼睛及臉部皮膚受傷。

4.快門按下後，將影像存檔，即可直接以熱感紙印出電泳圖之影像。

5.由DNAmarker各條帶（band）之位置（如圖三），可推測各DNA樣品之大小（bp,basepair）。

另外，可將DNAmarker及樣品條帶在電泳中之移動距離量出，作為橫座標（單位cm），並以已知bp值作縱座標，在半對數表上作圖，可得DNA長度之log值和其在電泳中之移動距離呈線性反比關係（如圖二）。

1.5μl3μl

圖三實習中所用之Gen-100DNAladder（GeneMark,TechnologyCo.,Ltd.,Tainan,Taiwan）（2%0.5XTAEGel）

參考文獻

國立中興大學遺傳工程中心。

1999。

暑期基礎分子生物技術。

國立中興大學，台中，台灣。

國立屏東科技大學。

1998。

生物技術基礎實驗。

睿煜出版社，屏東，台灣，221頁。

曾義雄，陳信芬，陳慶三。

1987。

電泳分離技術研討會論文集。

行政院國家科學委員會，台北，台灣，98頁。

Sambrook,J.,E.F.Fritsch,andT.Maniatis.1989.MolecularCloning:

aLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.