细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量.docx
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细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量
蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等,可以根据实验目前选择最合适的方法,本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备,试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。
蛋白提取方法
1材料和方法
1.1材料
1.1.1组织和细胞的来源:
1.1.2仪器设备
机械组织匀浆器
低温高速离心机(>40,000g)
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3试剂
三氯醋酸(TCA)
丙酮
二硫苏糖醇(DTT)
尿素
CHAPS
PMSF
EDTA
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4溶液配制
(1)PBS:
NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4,溶于800ml水中,用HCl调pH至7.4,用纯水定容至1L;
(2)EDTA储存液:
18.61gNa2EDTA•2H2O,溶于70ml纯水中,用10mol/LNaOH调节pH值至8.0(约需2gNaOH颗粒),定容为100ml。
可高压灭菌后分装备用;
(3)亮肽素储存液(50μg/ml,100×)
10mg/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50μg/ml储液,-20℃保存;
(4)抑肽素储存液(70μg/ml,100×)
1mg/ml溶于甲醇,-75℃保存;使用时配成70μg/ml储液,-20℃保存;
(5)PMSF储存液(10mM,100×):
17.4mgPMSF,溶于1ml异丙醇中,-20℃保存。
DTT储存液(1M):
0.31gDTT溶于2mlH2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。
(7)裂解液:
LysisbufferA
(9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)
LysisbufferB
(7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)
LysisbufferC
40mMTris-base(pH9.5)inultrapureH2O
LysisbufferD
(8Murea,4%CHAPS,40mMTris(base),40ml)
LysisbufferE
(5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)
LysisbufferF
100μLSDSsamplesolution(1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol)
●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
蛋白酶抑制剂混合物[3]
成分终浓度
蛋白酶抑制剂混合物PMSF35μg/mlor1mM
EDTA0.3mg/ml(1mM)
抑肽素0.7μg/ml
亮肽素0.5μg/ml
1.2方法
1.1.1组织蛋白提取方法
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步;
(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;
(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中;
(4)蛋白–20℃沉淀过夜;
(5)35000×g(6℃)离心30min;
将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;
(7)-20℃放置1h;
35000×g(6℃)离心30min;
(9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥的沉淀;
(10)在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液);
(11)15℃,40000×g,离心1hr;
(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度,分装后置–75℃保存。
1.2.1.2超速离心法
(1)取材;
(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆30s;
(3)组织悬液15℃,10000×g离心10min;
(4)上清液4℃,150000×g超速离心45min;
(5)小心避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;
取离心上清。
Bradford法定量,分装后置–75℃保存。
1.2.2培养细胞蛋白提取
1.2.2.1循环冻融法
(1)吸出培养液弃去,0.01mol/LPBS洗一次;
(2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;
(3)500×g,离心5min;
(4)弃上清,PBS洗三次(室温,500×g,5min),
(5)在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中;
执行Biofuge存储程序8,500×g5min离心;
(7)用200μl微量加液器吸出PBS,弃去;
吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,巴氏滴管混匀,液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s,室温融化),DTT在第一次冻融后加入;
(9)执行Biofuge存储程序6,15℃,40000×g,离心1hr(Biofuge);
(10)上清Bradford法定量,沉淀-75℃保存备用。
1.2.2.2超声破碎法
(1)取对数生长期的细胞,吸出培养液弃去,0.01mol/LPBS洗一次;
(2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;
(3)室温,500×g,离心5min;
(4)弃上清,PBS洗3次(室温,500×g,5min);
(5)在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendorf管中,500×g离心5min;
吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,混匀,移入1.5mlEppendorf管中,冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s);
(7)15℃,40000×g,离心1hr(Biofuge);
上清Bradford法定量,沉淀-75℃保存备用。
2.结果和讨论
蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。
我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法;破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。
循环冻融法操作简便,比较适合提取培养细胞的稳定蛋白,我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。
使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度,即刚好低于溶液产生泡沫的水平。
因为产生泡沫会导致蛋白质变性,同时要注意散热。
匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。
由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小,所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法,我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法;由于神经组织比较柔软,液氮研磨法也很适合,本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织,中枢神经组织由于富含脂类,沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离,但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。
高速离心的缺点是需要样品量大,如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml,不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中,我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物,原因是这一配方经长期使用很稳定,裂解效率也较高,非常适合小量细胞蛋白提取要求。
针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用,高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度,尿素就容易析出,影响蛋白的溶解),过量的去污剂也可以减少脂类的污染,两性电解质可以提高蛋白的溶解度,同时有利于等待聚焦。
早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解,但是由于盐离子的引入,导致IEF电压过低,影响聚焦。
蛋白抽提纯化过程中务必保证实验的试剂、仪器等整个实验过程中没有蛋白酶的作用,一定要抑制蛋白酶的活性,可以通过加入苯甲基磺醯化氟PMSF和AEBSF抑制苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性、加入EDTA抑制金属蛋白酶活性,高的pH可以抑制大多说蛋白酶活性。
、
细胞总蛋白的提取及裂解液
一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或
(10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000转×3分,用PBS0.4-0.5ml重悬(室
温),加入饱和浓度二抗(1/100)或(20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后
(迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uMNa3VO4
5mMEDTA,10mMNaF)),
离心4000转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度
108/ml?
)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml
的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。
4度离心15000g20min。
上清液即为全部细
胞溶解成分。
二.裂解缓冲液:
50mMTris-HClpH7.6或20mMHepespH7.4
150-300mMNaCl
1%(w/w)NP-40(0.5%Triton-X100)
5mMEDTA(现加1ml加10ul)
临用前加入蛋白酶抑制剂:
Na3VO4
钒酸钠1mM(75mM—13.3ul/ml)
(用0.2mol/L储存液配制)
PMSF苯甲酰氟1mM(10mg/mlPMSF用量:
10ul/ml)
或10-20ug/mlSoybeanTrypsininhibitor(加10-20ul)
Aprotinin抑肽酶10ug/ml(10ul/ml)
(Leupeptin亮肽素10ug/ml未加)Westernblotting
三.给你介绍一个裂解液:
50mMTris-HCl(PH8.0)缓冲液,含:
NaCl150mM
叠氮钠0.02%
SDS0.1%
NP-401%
PMSF100ug/ml(使用前临时加入)(10mg/mlPMSF用量:
10ul/ml)
尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS上样buffer。
四.我的样品蛋白是这样制备的:
1.将与腺病毒转染液共培养24小时的细胞消化下来
2.离心收集细胞
3.向离心管里加入40微升1×PBS缓冲液,随后再加入40微升2×Lamily
buffer(由tris碱和SDS组成)裂解细胞
4.将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟,放冷后离心.
5.测定蛋白浓度,加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端,不是指加样孔下面有蛋白.胶的浓度应该没
问题。
五.碧云天公司技术支持
Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mMTris(pH7.5),150mMNaCl,1%
TritonX-100,以及焦磷酸钠,β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin
等多种抑制剂。
可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。
(-20
℃保存,一年有效。
)
如果是贴壁细胞,按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例(即细胞培养液量
的1/20)加入裂解液。
六.军科院技术支持
裂解液(50mmol/LTris?
HClpH8.0,150mmol/LNaCl,1%TritonX-100,100ug/ml
PMSF):
1mol/LTris?
HCl(pH8.0)2.5ml
NaCl0.438g
TritonX-1000.5ml
蒸馏水至50ml
混匀后,4℃保存。
使用时,加入PMSF至终浓度为100ug/ml(0.87ml裂解液
加入1.74mg/mlPMSF50μl)。
七.操作方法:
蛋白样品制备:
(1)单层贴壁细胞总蛋白的提取:
1、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置
一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
2、每瓶细胞加3ml4度预冷的PBS(0.01MpH7.2~7.3)。
平放轻轻摇动1min
洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。
将
PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10ulPMSF(100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无
结晶时才可与裂解液混合。
)
4、每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂
解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪
将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
(整个操作尽量在冰上进行。
)
6、于4度下12000rpm离心5min。
(提前开离心机预冷)
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20度保存。
考马斯亮蓝法
也称考马斯蓝染色法(coomassiebluestaining)又称Bradford法。
由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。
考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,最小可测2.5μg/mL蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.Bradford浓染液的配制:
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,然后,用蒸馏水补充至1000ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2.标准曲线蛋白质样本的准备:
尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3.将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4.按1:
5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。
5.每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min。
染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。
注意,显色反应不得超过30min.
6.根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意:
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
蛋白质浓度测定的方法有很多,考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作简便,下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
实验原理
考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。
完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:
去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待测蛋白质溶液。
人血清,使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。
三、器材
试管1.5×15cm(×6),试管架,移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温
水浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作。
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液(mL)
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.15mol/LNaCl(mL)
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂(mL)
5mL
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线:
以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
注意事项
在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。
考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线?
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
(一)、试剂:
1、考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:
1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:
试管编号0123456
100ug/ml标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.6
0.15mol/LNaCl(ml)10.90.80.70.60.50.4
考马斯亮蓝试剂(ml)5555555
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X()+6
一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量的测定:
样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
4、对照:
用被测物质以外的物质作空白对照。
一、原理
考马斯亮蓝G-250(CoomassieG-250)是一种甲基取代的三苯基甲烷,分子中磺酸基的蓝色染料,在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移,在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收,因此,可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
利用溶液颜色的差异进行比色测定,适合于蛋白质类的定量分析,尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高,最低测试蛋白质量在1ug左右。
二、操作步骤
1.标准曲线测定法
分别取六只试管,其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白,5只分别加入不同体积的浓