高效液相色谱法分析芳香类化合物.docx
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高效液相色谱法分析芳香类化合物
高效液相色谱法分析芳香类化合物
系别：
化学物理系
学号：
PB09206108
姓名：
倪宇飞
高效液相色谱法分析芳香类化合物
1、实验目的
（1）了解高效液相色谱仪的基本结构及基本作用；
（2）了解色谱分离的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律；
（3）掌握色谱的基本定性、归一化定量方法。
2、实验原理
以液相为流动相的色谱称为液相色谱。
广义的讲，可以分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱。
如果按照两相分离过程的物理化学原理进行分类，可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱、亲和色谱等。
高效液相色谱适合于分析沸点高不易挥发、受热不稳定易分解的、分子量大的、不同极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。
它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%.。
1.吸附色谱
吸附色谱法又称为液固色谱法，是液相色谱法中发展历史最长的一种方法。
液固色谱法的固定相为固体吸附剂，常用的是碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。
固定相的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面呈现的吸附中心上进行竞争吸附，溶质分析反复的被吸附，又反复的被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱子中向前移动。
由于不同的待测分子在固定相表面的吸附能力不同，使得吸附-解吸附的速度也不同，导致各组分洗出的时间不同，实现各组分物质被分离，所以溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附-解吸附平衡就是液固吸附色谱具有选择性分离的基础。
2.分配色谱
分配色谱是基于样品分子在包裹与惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体直接按分配平衡的色谱方法，又称为液液色谱法。
在固液色谱中使用的固体吸附剂，如全多孔球形、无定形微粒硅胶、全多孔氧化铝等皆可作为液液色谱固定相的惰性载体。
但作为固定相的液体往往容易溶解到流动相找哦那个去，导致保留值减少，柱效下降，使得重复性很差，不大方便人们所采用。
直到化学键合固定相的出现，才使液液色谱得到广泛应用。
化学键合固定相是将固定相通过化学结合的方法结合到惰性载体上，这样固定相就不会溶解到流动相中。
常见的化学键固定相有十八烷基三氯硅烷等，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八碳烷基，其极性很小，而常用的流动相，如甲醇、乙腈以及它们和水的混合溶液，极性比固定相大，因此成为反相高效液相色谱；反之流动相的极性比固定相小，称之为正相高效液相色谱。
3.凝胶色谱
凝胶色谱与其他几种液相色谱不同，不是通过样品分子与固定相之间的相互作用力（吸附、分配和离子交换等）的差异被分离，而是根据样品分子的尺寸不同而达到分离目的，因而凝胶色谱又常被称作体积排阻或空间排阻色谱。
凝胶色谱以多孔性填料做固定相。
样品分子的分离受填料孔径的影响，比填料孔径大的样品分子不能进入填料的孔内，最先流出色谱柱。
填料颗粒上有很多不同尺寸的孔，在那些可以进入孔内的样品分子中，体积较大的分子可以利用的孔较少，所以样品分子按体积从大到小的顺序依次流出色谱柱。
在凝胶色谱中，流动相的作用不再是控制分离，而是溶解样品。
以有机溶剂作流动相的称凝胶渗透色谱（GPC），以水溶液作为流动相的成为凝胶过滤色谱。
4亲和色谱、离子色谱
亲和色谱与其他色谱伐相比较，其突出优点是可以对天然生物活性物质进行高特效的分离和纯化，具有高的浓缩效应，可以从大量的样品基本中分离纯化出所希望获取的少量生物活性物质。
这种特效的原因是在亲和色谱固定相基体上，键和了具有锚式结构特征的配位体。
离子色谱（GPIC），又称为离子交换色谱，分离机理为离子交换。
它是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的颗粒交换，依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。
它是离子色谱的主要分离方式，用于亲水阴、阳离子的分离。
5.仪器结构与原理
高效液相色谱仪最基本的组件是输液泵、进样器、色谱柱、检测器和工作站。
输液泵将流动相以稳定的速度（或压力）输送至待分析体系，通过进样器，载着待测样品进入色谱柱。
在色谱柱中，样品的各组分在色谱柱中被分离，并依次随流动相流至检测器监测到的信号送至工作站记录处理和保存。
（1）储液灌
液相色谱中所使用的储液灌应耐腐蚀可以为玻璃、不锈钢、氟塑材料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK），容积为0.5～2.0L。
储液灌必须放置于高于泵体的位置。
（2）输液泵
输液泵一般须具备以下特点
1.泵体材料耐化学腐蚀
2.能在高压下连续工作
3.输出流量范围宽
4.输出流量稳定，重复性高
（3）进样装置
本实验中使用的进样装置是较为常见的六通阀进样器，样品的进样体积用定量管来确定。
（5）色谱柱
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。
常用内壁抛光的不锈钢管座色谱柱管，其内径多为4.6mm或3.9mm，长度在10～15cm。
色谱柱内部紧密填充着大量的5～10μm粒度的颗粒作为固定相。
（6）检测器
检测器是用来连续监测经色谱柱分离后流出物的组成和含量变化的装置。
它利用被监测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被监测物质从色谱柱中流出时，会导致流动相的背景发生变化，从而在色谱图上一色谱峰的形式表现出来。
被实验中使用的检测器为紫外-可见光（UV-VIS）检测器，是目前在高效液相色谱中使用最广泛的检测器，它既具有较高的灵敏度和选择性，也有很广宽广的应用范围。
由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成变化不是很敏感，所以也可以用于梯度洗脱。
（7）工作站
液相色谱的工作站主要是用进行数据的采集和处理，一般都可以在线模拟显示，数据自动采集、处理和储存，并可对整个过程实现自动控制。
6.数据的处理方式
本实验采用的定量分析方式为归一化法，把所有的组分含量之和按100%进行计算。
归一化发的重要前提是样品中的所有组分都可以流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号。
由于存在杂质的原因，该方法并不能测定出样品中某组分的含量，只能测出个组分之间的含量之比。
计算公式为
其中Ai为组分i的峰面积；fi为组分i的质量（或摩尔、体积）校正因子。
3、仪器与试剂
1.仪器
Agilentseries1100型液相色谱仪：
真空在线脱气装置；四元梯度泵；多波长检测器；ODS-C18色谱柱；
2.试剂
甲醇（色谱纯）；水（超纯水）；苯、萘、菲的甲醇溶液，三种化合物的混合甲醇溶液。
4、实验内容
1.实验条件的确定
打开计算机，待计算机启动完毕后，依次打开输液泵、真空在线脱气装置、柱温箱、检测器开关。
通讯完毕后，设定操作条件。
流动相：
甲醇：
水=80：
20（体积流量比）。
总流速：
0.500ml/min
UV-VIS检测器设定在220nm、254nm两个波长下进行检测，柱温30oC，流动相的比例可以按照实验的需要在工作站自带软件的控制单元中修改。
2.定性分析（确定保留时间）
流动相比例设定为甲醇：
水=80：
20，等基线稳定后依次将苯、萘、菲的甲醇溶液进样5微升，得出三种标准物质的保留时间。
由于仪器在之前一直处于开启状态，故不需要等待基线之水平。
在流动相的组分为甲醇：
水=80：
20的条件下，工作站显示流动相压强稳定在约40MPa附近。
色谱测试结果如下表所示（对于单一组分的测试溶液，峰面积并没有实际应用的意义，故并未在这里写出）
苯
萘
菲
220nm保留时间/min
4.583
5.723
7.534
254nm保留时间/min
4.583
5.721
7.534
从这一结果可以初步看出色谱的UV-VIS检测器选择在的检测波长对于保留时间的影响并不大，影响保留时间的主要因素有进样器到色谱柱之间管线的规格，输液泵的流速，柱温，色谱柱的规格，流动相的物理性质等。
通常来说，同一物质在同一仪器相同条件下测得的保留时间大致相等。
其次，由于反相色谱中流动相的极性比固定相大，因此极性较大的溶质会先被洗脱，即极性大的溶质保留时间较短。
在本实验中也得到验证，苯、萘、菲的极性是递减的，反映在色谱图上就是它们在同一仪器相同测试条件下的保留时间递增。
3.将三种物质的混合溶液进样5微升，在同样的测试条件下，记录色谱曲线，确定各峰保留时间。
测试结果见下表
检测器波长
项目
苯
萘
菲
220nm
保留时间/min
4.601
5.730
7.537
峰面积
228.88731
2.44371×104
890.38922
254nm
保留时间/min
4.600
5.731
7.537
峰面积
937.72241
1785.11499
2211.303908
在测试混合溶液时，关于UV-VIS检测器检测波长的选择，并不是选用组分的最大吸收波长，因为不同组分的最大吸收波长并不相同，对于复杂组分的溶液来说，不可能使每个物质都达到最大吸收。
在实际实验中选择的是一个兼顾波长，即让尽可能对的组分在检测波长处有较强的吸收，且每个组分之间的吸收强度相差不可以太大。
与单组分的溶液进行对比，可以看到相应组分的保留时间并没有太大变化。
已知在254nm条件下，各物质的矫正因子分别是苯1.00萘0.08菲0.01.
校正因子的引入是为了解决混合溶液中不同组分在同一波长处吸光系数不同造成色谱图上相应峰面积不代表实际物质的浓度之比这一问题。
将数据带入之前的计算公式可得
需要注意的是计算出的结果并不是三种组分在混合溶液中占得比例，而是各组分在这三种组分中占得比例。
因为溶液中存在杂质（这一点从色谱图中的杂质峰也可以看出），且杂质的归一化因子是不可能得知的，因此无法算出某组分在溶液中实际的相对含量。
实际上三种组分在溶液中的相对含量是要略小于该值的。
由于将上面的形式化成精确的连比形式比较繁琐且没有太大意义，故这里不再化为连比形式。
从实验的结果可以看出无论是在混合样中还是独立的溶液，各组分显影的保留时间并没有变化。
4.流动相组成对混合样保留时间的影响
梯度条件
时间/min
函数
参数
0
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
80.0%水:
20.0%
4
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
90.0%水:
10.0%
5
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
100.0%水:
0.0%
设定开始是的流动相组分为甲醇：
水=80：
20；平衡至极限稳定后，开始进样。
完成一次梯度洗脱后将流动相的组分重新设定为初始状态，稳定10分钟后，开始第二次梯度洗脱。
测试结果如下表所示
检测器波长
项目
苯
萘
菲
220nm
保留时间/min
4.430
5.308
6.538
峰面积
430.60651
2.26765×104
882.17023
254nm
保留时间/min
4.431
5.307
6.538
峰面积
927.26422
1747.91797
2252.18433
计算结果的意义与之前相同，不再重复说明，值得注意的是，在进行梯度洗脱时可以看出随着时间的变化，流动相中有机组分的比例在上升，这也就使得每种组分的洗脱时间均变短，而且越是靠后的组分算短的时间越多，直观上看，色谱图中每个峰之间的距离变小了。
梯度条件2
时间/min
函数
参数
0
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
80.0%水:
20.0%
3
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
90.0%水:
10.0%
4
更改流动相溶剂组分
溶剂组分：
甲醇:
100.0%水:
0.0%
测试数据
检测器波长
项目
苯
萘
菲
220nm
保留时间/min
4.595
5.565
6.659
峰面积
221.01622
2.10591×104
945.32166
254nm
保留时间/min
4.594
5.568
6.659
峰面积
1001.71021
1913.46741
2325.88770
各组分含量
将两次梯度洗脱的结果进行对比可以看出相应的峰面积有大约10%的差距，且第二组梯度洗脱的保留时间比第一次洗脱略长。
这两次洗脱的区别在于第二次洗脱时流动相中甲醇比例的变化速率更快，即洗脱相的极性减小的更快，因此可以初步推知在梯度洗脱时，流动相的极性减小的越快，需要的洗脱时间越长。
注：
上述计算中涉及到的多有组分含量计算结果均为某一组分在三种组分中所占的比例，并不是在混合溶液中所占的比例。
5、思考题
（1）反相色谱的基本规律是什么？
为什么会有这样的规律?
反相色谱的基本规律是流经色谱柱的待测样品中极性较大的组分将会先被洗脱，即极性相对较大的的组分保留时间较短。
这是因为反相色谱的流动相的极性比固定相大，根据相似相容原理，极性较大的组分的更易溶解到流动相中，从而更容易被洗脱。
（2）反相色谱中流动相的组成对保留时间有何影响？
通常情况下认为洗脱速率与流动相中有机溶剂的比例有如下关系
lnk'=a+bM
其中k'是洗脱速率常数，M代表流动相中有机溶剂所占的比例，对于有机待测样品来说，有机溶剂所占比例越大时洗脱速率越大，保留时间越短（一般对于有机样品来说a是正值）。
（3）在什么情况下，可以用面积归一化发作定量分析？
有什么优缺点？
归一化法的前提是样品中所有的组分均能流出色谱柱，并在色谱的检测器上均能产生信号。
同时对于每一组分必须都确认其归一化因子。
对于杂质过多的样品不能使用归一化法。
归一化法是一种相对定量方法，其优点是简便、准确，特别是在进样量不容易准确控制时，进样量的变化对定量结果的影响很小。
其他操作条件，如流速、柱温等变化对定量结果的影响也很小。
归一化法的主要缺点是校正因子的确定比较麻烦，这要求必须提前知道样品的确切组成。
（4）采用梯度洗脱时对样品的分离有什么好处？
可以从实验的数据中看出，梯度洗脱时，每个组分的对应的峰间距发生了变化，有时若两个信号峰之间的间距过小，会导致计算积分面积时互相影响，使计算出的相对含量失准，这是可以借助梯度洗脱拉开两峰之间的间距消除这一影响。
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