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生物技术整理资料

第一章

第一节园艺植物生物技术的主要内容

一、园艺植物组织培养（tissuecultureinhorticultureplant）

1、概念：

无菌条件下，对园艺植物胚胎、器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其再生发育成完整的植株的过程。

（请与扦插、种子繁殖等方式进行比较）2、理论基础：

细胞的全能性3、园艺植物组织培养的主要内容（P2）

二、园艺植物细胞工程

概念（P2）：

以细胞为单位的组织培养

内容：

细胞培养、原生质体培养、细胞遗传操作（转基因、细胞融合）、细胞保藏等

三、园艺植物染色体工程

广义染色体工程：

染色体组和个别染色体工程

狭义（个别）染色体工程：

增加、减少或替换染色体

主要内容：

单倍体加倍迅速获得纯系；多倍体；代换系、附加系或易位系。

四、园艺植物基因工程

概念：

外源基因导入园艺植物、获得新的性状。

内容：

基因克隆；载体构建；转化；检测与鉴定

五、园艺植物分子标记

广义分子标记：

DNA与蛋白质标记

狭义分子标记：

DNA标记

内容（P4）：

基于杂交的分子标记；基于PC的标记；基于酶切与PCR相结合的标记；基于单核苷酸多态性的DNA标记

第二节园艺植物生物技术的发展简史与趋势

简吏

发展趋势1产业化：

基因工程、脱毒与快速繁殖2由转抗性向优质、高产等多种优良性状发展3常规育种与生物技术紧密结合的实用化进程加快分子标记技术胚挽救技术和细胞融合技术单倍体培养技术体细胞无性系变异与筛选技术4基因表达与功能研究更加深入

第二章

第一节脱毒方法

病毒危害：

植物的病毒迄今为止有文献记录的为300多种（不包括不同株系），受病毒危害的植物很多，多数的农作物，特别是无性繁殖作物，都受到一种或一种以上病毒的侵染。

植物病毒病原体可通过维管束传导。

因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。

受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。

侵入途径：

植物病毒只能通过不至于造成寄主细胞死亡的微小伤口才能完成侵入，有些病毒是通过在寄主的细胞壁上机械地造成微伤而侵入的，有些却需要特定的昆虫刺吸式口器，把病毒输入寄主的薄壁组织或韧皮部中，并建立寄主关系。

危害症状：

当植物受到病毒侵染以后，由于寄主植株本身的正常新陈代谢等生理机能受到干扰，使叶绿体的合成、花青素生产和激素的合成分配等受到显著影响，从而使寄主植株的外观也表现出不正常状态。

如植株矮小、叶片失绿或变色、分蘖及枝芽增加以及果、叶畸形等。

园艺植物中有相当多的种类是采用无性繁殖法，即利用茎、根、枝、叶、芽等通过嫁接、分株、扦插、压条等途径进行繁殖的，病毒通过营养体传递给后代，使危害逐年加重，而且园艺植物通常呈规模化集约栽培，易造成连作危害，加重了土壤传染性和线虫传染性病毒的危害。

防治：

病毒病害与真菌和细菌病害不同，不能通过化学杀菌剂或抗生素予以防治。

现虽有人从事病毒抑制剂的研究，但由于病毒的复制增殖是在寄主体内完成，与寄主植物正常的生理代谢过程密切相关，而且现有的病毒抑制剂对植物也都有害，同时抑制剂不能治愈植物全株，当药效消失时病毒就很快恢复到原来的浓度。

用化学杀虫剂消灭传播媒介昆虫（蚜虫、叶蝉、线虫、螨类等）能减轻一些病毒的蔓延，但对于机械传播，用化学杀虫剂则不能控制这类病毒病。

“脱毒苗”是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。

要脱除植株体内所有病毒包括未知病毒是不可能的。

脱苗可通过群体中未受病毒侵染的植株无性繁殖获得。

由于病毒不经种子传播（豆科种子除外），因而也可通过种子繁殖获得无病毒植株。

一、茎尖培养脱毒二、热处理脱毒三、热处理结合茎尖培养脱毒四、其他脱毒方法

一、茎尖培养脱毒

（一）通过茎尖培养脱毒的原理

1．病毒在植物体内的分布

茎尖、根尖分生组织不含病毒粒子或病毒浓度很低。

是因为病毒在寄主植物体内随维管系统（筛管）转移．在根尖与茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动困难。

病毒在寄主茎尖分生组织中的转移速度落后于茎（根）尖的生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，培养便可获得无病毒再生植株

2．茎尖大小与脱毒效果

用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最大直径1.0mm；通常是带1～3个叶原基的茎尖（约0.3～0.5mm）。

茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。

但不带叶原基的过小，外植体离体培养存活困难，生长缓慢，操作难度大。

茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，而分生组织以下的1～3个幼叶原基可合成并供给分生组织生长素、细胞分裂素。

因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。

但茎尖外植体过大，脱毒效果差。

二）茎尖脱毒的方法

．取样：

用于脱毒的植株应是患病群体中病害相对较轻的植株。

可直接从选定的植株上取梢段进行消毒接种。

也可从室内培养1～2月并进行热处理的盆1栽扦插苗上，采顶芽与侧芽消毒接种。

2．消毒：

剪取梢段（也可用侧芽）3～5cm，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75％酒精中浸泡30s左右，用1％～3％次氯酸钠或5％～7％的漂白粉溶液消毒10～20min（或用0.1％HgCl2消毒数分钟），最后用无菌水冲洗材料4～5次。

3．剥取茎尖与接种

在超净工作台上，将已消毒的芽放在垫有无菌滤纸的培养皿中（已灭菌）。

在双筒解剖镜下，用解剖针或镊子将材料固定于视野中，用解剖刀尖仔细剥去幼叶，至出现裸露的生长点。

用刀尖切下带1～2个叶原基的生长点（约0.3～0.5mm）。

用解剖针或解剖刀尖将切下的茎尖转至培养基上（顶部向上），每管接1～2个茎尖。

为防止茎尖失水，可用无菌水润湿滤纸。

操作中注意随时更换滤纸和接种工具，剥取茎尖时切勿损伤生长点。

4．培养接种后材料置25±2℃，光照度1500～5000lx，每日光照10～16h条件下培养。

温度对茎尖培养的影响不及光照。

不同植物茎尖培养适宜的光强与光照时间不同，但一般光照培养比暗培养效果好。

培养两个月左右，大的茎尖再生出绿芽，小的（0.1～0.5mm）茎尖则需3个月以上，有的甚至更长时间才发生绿芽。

其间应更换新鲜培养基。

提高培养基中BA的浓度，可形成大量丛生芽。

5．生根诱导一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不定根。

而另一些植物不产生不定根，必须将无根绿苗再诱导才能生根成为完整植株。

诱导生根的方法是将2～3cm高的无根苗转入生根培养基，继续培养1～2个月即可形成根。

一些植物茎尖离体培养极难生根，即使转入生根培养基诱导也难奏效（如桃、苹果），这类植物的无病毒绿芽可通过微体嫁接法获得完整植株。

如果取茎尖脱毒试管苗的茎尖（可大于第一次切取的茎尖），再培养，即二次茎尖培养脱毒率可达100％。

（三）培养基与培养方式

1．培养基合适的培养基对茎尖诱导成完整植株有重要影响。

MS培养基适于多种植物茎尖培养。

White、Morel等培养基也有广泛的应用。

植物应严格控制培养基中糖的浓度。

培养基中加入生长素（IAA、NAA）和细胞分裂素（KT、BA）或椰乳，对促进不同大小的茎尖外植体生长和分化是必要的。

GA3的适当配合，促进效果良好。

2,4-D常导致愈伤组织发生，应避免使用。

2．培养方式

茎尖培养一般常采用半固体（琼脂培养基）培养，但去掉琼脂的液体培养基效果（滤纸桥）更好。

二、热处理脱毒

热处理或温热疗法。

其基本原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35℃～40℃）即钝化失活。

因而将植物置于一定高温下处理一段时间后，病毒失活而植物基本不受伤害。

由于通过组织培养脱毒的各种方法均有一些不足之处。

这些病毒及一些类病毒难以通过茎尖培养、微尖嫁接或愈伤组织培养脱除，而用热处理则可以脱除。

热处理方法

（1）温汤处理将材料放置50℃左右热水中浸数分钟至几小时，可使病毒失活。

此法简便易行，适于离体材料和休眠器官的处理，缺点是易伤害材料。

（2）热风处理

将盆栽植物移入室内或生长箱中，以35℃～40℃温度处理几十分钟至数月。

按植物种类、器官类别和生理状况及待脱除病毒的种类等，确定处理温度与处理时间。

如草莓以36℃处理6周可脱除轻型黄边病毒（SMYES），马铃薯以37℃处理20d就可脱除卷叶病毒（PLR）。

此外，每种植物都有热处理临界温度，过高温处理会造成对植物的伤害。

采用变温处理则可消除病毒不伤及植物，如以每天40℃4h与16℃～20℃20h交替变温处理马铃薯块茎，既清除了芽眼中的病毒，又保持了芽的活力。

三、热处理结合茎尖培养脱毒

尽管分生组织常常不带病毒，但也有一些植物茎尖带有病毒。

在麝香石竹0.1mm的茎尖培养中，33%的材料带有麝香石竹斑驳病毒。

在菊花茎尖培养中，由0.3～0.6mm长的茎尖愈伤组织形成的植株全部带有病毒。

已知能侵染茎尖分生组织区域的其他病毒还有马铃薯花叶病毒（TMV）、马铃薯X病毒（PVX）以及黄瓜花叶病毒（CMV）。

在这种情况下，把茎尖培养和热处理结合起来，能明显提高脱毒率。

热处理结合茎尖培养法是在单独使用热处理或单独使用茎尖培养都不奏效时使用。

如侵染菊花的病毒有10余种，象菊花矮缩病毒（CSV）和菊花番茄不孕病毒（TAV），就可以通过使植物在35℃～38℃条件下，处理2个月，来达到经热处理使病毒失活的去病毒效果（不经组织培养）。

如果要去除或尽量削弱退绿斑驳病毒、轻斑驳病毒、B病毒等，则单用热处理难以奏效，必需通过茎尖培养结合热处理来实验脱毒效果。

如，在38℃下处理140d，未能去除康乃馨蚀环病毒，结合茎尖培养则可以除去。

热处理可以在茎尖离体之前的母株上进行，也可以在茎尖培养期间进行。

前一种方法可以使母枝快速生长，茎尖生长速度远远高于病毒复制和传播的速度，离体茎尖外植体可以比不经热处理的大一点，这样既可以保证高的脱毒率，又可以提高离体茎尖的存活率和再生植株百分数。

热处理结合茎尖培养的脱毒方法已成功地用来对马铃薯、菊花、石竹、草莓进行脱毒。

四、其它脱毒方法

（一）愈伤组织培养脱毒

（二）珠心胚培养脱毒（三）微尖嫁接脱毒四）花药培养脱毒（五）蒜薹圆盘培养脱毒（六）化学处理

（一）愈伤组织培养脱毒将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。

依据是愈伤组织细胞带病毒不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生出的植株是无病毒的。

多次继代的愈伤组织中病毒浓度下降。

甚至检测不出病毒。

愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因

一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制速度较慢，赶不上细胞的繁殖；

二是愈伤组织细胞发生了抗病毒突变。

此外，在母株上也存在抗病毒的细胞，它们与感病毒的细胞并存，采用它们存在部位的组织离体培养，所获再生植株中有较高比例的无毒株。

马铃薯茎尖愈伤组织再生植株中，不含马铃薯X病毒（PVX）植株的频率高达46％，远高于茎尖直接成苗植株的频率。

（二）珠心胚培养脱毒

柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外，还有多个珠心胚。

珠心胚由珠心组织细胞即体细胞分化形成，具有和母体相同的遗传特性。

病毒一般不通过种子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株是无毒的，同时又保存了母株的遗传特性。

柑橘珠心胚培养直接取花后约7周的幼果胚囊，接种后，先在25±2℃黑暗条件下培养一个月，再转光照培养（1000lx，12h）。

3～4周即发生球形胚和愈伤组织，9～10周分化子叶，苗高3cm左右移植到营养钵蛭石基质中继续培养，7周左右可移栽到土中。

珠心胚大多不育，必须经分离培养才能长成正常植株。

此外，珠心胚苗处于童期，长势强旺，还带有部分野生性状（多刺），结果迟，柑橘珠心胚苗需栽培7～8年才能结果，占地费时。

使这项技术的应用受到很大制约。

为了缩短珠心胚苗的童期，可将珠心胚芽嫁接到栽培3年的实生砧木上，以促其早结果

（三）微尖嫁接脱毒

微尖嫁接技术，指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（0.14～1.0mm，带3～4个叶原基）以培养脱毒苗的技术。

这一方法适用于茎尖培养脱毒生根困难，不能形成完整植株的植物，如柑橘、桃、苹果等。

茎尖来源包括成年无病毒植株的茎尖、热处理或温室培养植株的茎尖以及脱毒试管苗茎尖等，以热处理植株茎尖嫁接应用最广泛。

微尖嫁接脱毒主要程序

无菌砧木培养→茎尖准备→嫁接→嫁接苗培养→移植。

1．砧木培养用新鲜果实种子去种皮后接种子含MS无机盐的无激素琼脂培养基上，在25±2℃下暗培养2周，再转光照培养。

2．茎尖准备供体株多用热处理或温室培养植株，对采集的嫩稍消毒和剥取茎尖

3．嫁接从试管中取出砧木，切去过长的根，保留4～6cm根长，切顶留1.5cm左右茎。

在砧木近顶处一侧切一个“U”形切口，深达形成层，用刀尖挑去切口部皮层。

将茎尖移置砧木切口部，茎尖切面紧贴切口横切面。

4．嫁接苗培养微尖嫁接苗一般采用液体滤纸桥方式培养。

事先在纸桥中开一小孔，将砧木的根通过小孔植入液体培养基，按常规光照培养管理。

开始可用较低光强800～1000lx。

长出新叶后可提高光强。

5.移栽嫁接苗培养3～6周，具2～3片叶时按一般试管苗移植方式移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。

“再嫁接式移栽”

即将嫁接苗去根并削去砧木部分的皮层作为“接穗”，嫁接到盆栽粗壮砧木上，扎紧切口井罩以塑料袋保湿，20d左右成活，即可摘去塑料袋。

用再嫁接式移栽的柑橘微尖嫁接脱毒苗成活率高。

（四）花药培养脱毒

1974年日本大泽胜次首先发现，草莓花药培养可产生无病毒植株。

国内外研究证实，草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒率，一般可达80％以上；有些报道指出可达100％。

因此，大泽胜次认为草莓花药培养脱毒，可以免去脱毒检测程序。

草莓花药培养产生二倍体植株频率很高，且操作较茎尖培养脱毒简便。

这些特点使草莓花药培养脱毒成为当前国内外草莓无病毒苗培育主要方法之一。

（五）蒜薹圆盘培养脱毒

将表面消毒的感病大蒜的鳞片（蒜瓣）切成薄片，接种在含激素的培养基上，5d后从圆盘表面长出半球体，看起来很像是生长点，在培养10d之前半球体是无毒苗的。

在培养的5～7d后，将半球体从外植体上剥离，转移到无激素的LS培养基上，经过2周长成高约1cm的苗，8周后形成带根的高约8cm的试管苗。

移栽到土壤中后，它们生长健康，不呈现带病毒症状

（六）化学处理

1.病毒抗血清预处理用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。

2.RNA抑制剂处理烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。

放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。

3.三氯唑核苷：

病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。

第二节脱毒苗鉴定

一、直接检测法二、指示植物法三、抗血清鉴定法四、分子生物学鉴定法五、电镜检测法

一、直接检测法直接观察植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒可见症状，从而可判断病毒是否存在。

如矮缩病毒引起寄主植物叶片腿绿、坏死、扭曲、植株矮缩，花叶病毒引起寄主植物叶片脉间失绿等。

简便、直观、准确。

二、指示植物法对某种或某几种病毒及类似病原物或株系具敏感反应并表现明显症状的植物称为指示植物。

（一）草本指示植物鉴定

1．汁液涂抹法：

取待测植物幼叶1～3g，加少量水及等量0.1mol/l磷酸缓冲液磨成匀浆。

在指示植物叶上涂上一薄层500～600目的金刚砂，用脱脂棉球蘸匀浆在叶片上轻轻摩擦，以汁液进入细胞又不损伤叶片为度。

5min后，以清水冲洗叶面多余的匀浆及金刚砂。

置放虫网内数天至数周。

观察是否有症状。

2．小叶嫁接法

取待测植物小叶嫁接到指示植物叶上，根据被嫁接指示植物叶上有无病毒症状，鉴定待测植物病毒。

每株指示植物至少嫁接2片小叶，若待测植物有病毒，嫁接后15～25d，即会产生症状。

二）木本指示植物鉴定

1．直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片。

２．双重芽嫁接先将指示植物的芽嫁接到实生砧木基部距地面10～12cm处，再在接芽下方嫁接待检植物芽，两芽相距2～3cm。

成活后剪去指示植物芽上部砧干。

夏秋季芽接，次年可观察。

（3）双芽嫁接法

在休眠期剪取指示植物和待检植物的接穗，萌芽前分别把

带有两芽的指示植物接穗与待检植物接穗同时切接在实生砧木上，指示

三、抗血清鉴定法

（一）原理人和动物感病后，血清中会产生抗体。

刺激抗体产生的物质多为蛋白质，称为抗原。

抗原与抗体间能发生高度专一性的反应，称为血清学反应（免疫反应）

抗体存在于血清中，故叫抗血清。

植物病毒是核酸和蛋白质组成的复合体，因此，也是一种抗原，注射到动物体内，会引起相应特异抗体的产生。

因此，利用特定病毒的抗血清．通讨血清学反应即可检测该种病毒。

抗血清鉴定方法专一性强、快速简便。

分离纯化病毒（抗原），制备纯净的抗血清是抗血清鉴定中最关键的环节。

植物病毒抗血清的制备方法是：

先提取、纯化植物病毒，将高纯度病毒注射到动物（如家兔、山羊、老鼠）体内，再从动物血液中提取和纯化抗血清

（二）方法

1．叶绿体凝集法采用待检植物叶片提取液与专一抗血清发生凝结反应检测植物病毒，如烟草花叶病毒，马铃薯Y病毒等长形病毒

2．试管沉淀法即各种稀释的抗血清与病毒抗原在小试管中混合反应而产生沉淀，是常用的病毒检测方法之一。

长形病毒形成絮状沉淀，球形病毒形成浓密粒状沉淀。

3．环形接口法在毛细管或细长玻管中，抗原抗体通过扩散结合。

病毒抗原位于上部呈层状，少量抗血清向毛细管渗入，至达到足够的抗原/抗体比率时，在该区域产生可见沉淀物。

此法简单快速。

4．酶联免疫吸附分析法（ELISA）

基本原理是用化学处理方法将酶与抗体（或抗原）结合，制成酶标抗体（原），这些酶标记物仍保持其免疫活性，能与相应抗体或抗原特异结合形成酶标记免疫复合物，遇相应底物时，免疫复合物上的酶催化无色的底物，降解生成有色产物或沉淀物，前者可用比色法定量测定，后者可肉眼观察或通过光学显微镜识别。

四、分子生物学鉴定法

1．双链RNA法（dsRNA）在受RNA病毒侵染的植物体内，有相应复制形式的双链RNA（dsRNA）存在，而在健康植株中未发现病毒的dsRNA。

通过提取纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定有无dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。

2．互补DNA（cDNA检测法）

用互补DNA（cDNA）检测病毒的方法又称DNA分子杂交法。

根据碱基互补原理，人工合成能与病毒碱基互补的DNA（cDNA）即cDNA探针，用cDNA探针与从待检植物中提取的RNA进行DNA－RNA分子杂交，检测有无病毒RNA存在，从而确定植物体内有无该病毒。

合成cDNA时，采用同位素标记。

因而检测结果可通过放射自显影显示在图像上，直观、准确。

3．聚合酶链式反应PCRreversetranscriptionPCR,RT-PCR

五、电镜检测法

运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态、大小对病毒种类进行鉴定。

完整成熟的病毒称为病毒粒体，有固定形态和大小。

病毒粒体的形态有杆状、线状、球状3种。

ISEM：

把电镜检测与血清学方法结合建立了免疫吸附电镜检测法（ISEM）。

ISEM具有更高灵敏度并能测定植物粗提取液中的病毒。

第三节脱毒苗的繁殖和保存

一、脱毒苗的繁殖

脱毒苗的培育是很不容易的，因此一旦培育获得脱毒苗植株，就应尽快繁殖扩大以应用于生产。

通常的繁殖方法是将得到的脱毒植株在无菌条件下切段繁殖，利用腋芽在离体培养条件下，诱导形成大量脱毒小苗。

离体条件下采用切段繁育获得的大量脱毒苗，应种植在防虫网室内，一般以使用300目的网纱为好，网眼为0.4～0.5mm大小的规格，可以防止昆虫类介体进入。

栽培苗床的土壤应进行消毒，周围环境也要整洁，及时打药灭菌，保证种植的脱毒苗在远隔病毒传染源的条件下生长发育。

有条件的地方可以找合适的海岛或高冷山地，气候凉爽，虫害少，有利于脱毒植株的生长、繁殖。

马铃薯良种生产体系

（一）生产原原种利用脱毒苗生产无任何病害的原原种，是良种生产体系的核心。

生产原原种可利用脱毒苗移栽法，但目前最经济有效的方法是用脱毒苗在温室（网室）中切段扦插。

其优点有三：

①节省投资。

②繁殖速度快。

③方法简单

（二）生产原种原原种生产成本高，生产的种薯数量有限，远不能用于生产，所以需要把原原种扩大繁殖，生产一级和二级原种。

原种的生产规模比原原种大得多，不可能全用温室或网室。

虽然如此，但仍需要生产高质量的种薯，特别是一级原种应接近完全健康。

因而生产原种需要选择适当的地点。

原种生产田应具备的条件：

①地势高寒，蚜虫少。

②雾大、风大，有翅蚜虫不易飞迁、降落的地方。

③天然隔离条件好，如森林中间的空地，四周环山的高地，海边土质好的岛屿等。

④无传播病毒和细菌性病害的土地。

（三）生产良种

良种来自一级原种或二级原种。

第一次用原种生产的种薯为一级良种，一级良种再种一次即为二级良种。

一级原种的种薯量大时可直接用来生产一级良种，一级良种的种薯量大时可直接向种植户提供种薯。

种植户生产的马铃薯只能供市场销售食用，不作种薯。

但如果一级原种或一级良种的种薯量少，均可再繁殖一次到二级原种时才生产一级良种，把一级良种再繁殖一次的种薯供给种植户生产上用。

二、脱毒苗的保存

（一）隔离保存

应将脱毒原原种苗种植于防虫网室、栽在盆钵中保存。

栽培基质应事先消毒处理。

除去网室周围的杂草和易滋生蚜虫等传播媒介的植物，保证环境清洁，并定期喷药剂防虫杀菌。

凡接触脱毒苗的工具应消毒并单独保管专用，操作人员也应穿消毒的工作服。

若有条件，最好将脱毒苗母本园建在相对隔离的山上。

对隔离保存的脱毒种苗要定期检测有病毒感染，及时将再感染的植株淘汰或重新脱毒。

若管理得当，材料可保存5~10年。

二）离体保存将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，在低温下离体保存，是长期保存植物无病毒原种及其他优良种质的方法。

1．低温保存2．超低温保存

1．低温保存茎尖或小植株接种到培养基上，置低温（1～9℃）、低光照下保存。

低温下材料生长极缓慢，只需半年或一年更换培养基一次，此法又叫最小生长法。

2．超低温保存超低温主要指液氮（－196℃）及液氮蒸汽相条件。

冷冻和化冻过程最易引起材料的伤害。

原因主要有两个方面：

一是细胞内部结冰，造成细胞结构的破坏，细胞死亡。

二是细胞内溶质的浓缩。

细胞质最初是高渗透压的，故一般先致细胞外结冰，增加了细胞外溶液的浓度，导致细胞膜内外的渗透压梯度发生反转，即细胞失水，并逐渐变为脱水状态。

植物材料在超低温下长期保存，并在解冻后正常地进行细胞分裂和分化，在冰冻过程中要避免细胞内水分结冰，在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰。

冷冻保护剂有二甲基亚砜、聚乙二醇（PEG）、甘油及多种糖类等。

（三）生长抑制保存

通过高渗、生长抑制剂以及其他一些措施达到延缓离体培养材料生长发育，延长继代转接时间，从而达到保存离体培养材料的目的。

1．生长抑制剂保存法是在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料生长，达到长期保存种质材料的保存方法。

常用的生长抑制剂有ABA、青鲜素、矮壮素（CCC）、多效唑、烯效唑、B9等，它们可以有效控制和延缓培养材料的生长速度，延长继代培养周期，而且可以使其生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率极大提高。

2．抑制生长的其它保存法

（1）饥饿法从培养基中减去1～2种营养元素，使培养植株由于营养缺乏而处于最小生长量。

2）矿物油覆盖法利用矿物油覆盖培养材料使其与空气隔绝，延缓生长。

如胡萝卜愈伤组织在覆盖一层植物油的试管中培养，26℃下，5个月继代一次，可以保存活力达3年。

3）低温、低光照培养法在低温条件下，适当减弱光照强度、缩短光照时间可以减缓试管苗生长。

如