生物化学常用试剂配制.docx
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生物化学常用试剂配制
常规试剂配制与测定方法
一、溶液的配制
1、Mandels营养盐溶液（1000mL）
名称
重量（g）
硫酸铵（（NH4）2SO4）
14
磷酸二氢钾（KH2PO4）
20
尿素（H2NCONH2）
3
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
3
氯化钙（CaCl2·2H2O）
4
注:
用煮沸10min后的蒸馏水配制。
2、Mandels微量元素溶液（1000mL）
名称
重量（g）
氯化钴（CoCl2·6H2O）
3、7
硫酸锌（ZnSO4·7H2O）
1、4
硫酸锰（MnSO4·H2O）
1、6
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）
5、0
注:
用煮沸10min后的蒸馏水配制。
3、DNS试剂的配制（1000mL）
（1）取:
3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7、5g
氢氧化钠（NaOH）14、0g
充分溶解于1000mL水中（水预先煮沸10min）
（2）加入:
酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216、0g
苯酚（在50℃水浴中融化）5、5mL
偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）6、0g
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中,放置5天后便可使用,平时盛一小瓶（250mL）使用,要放在冰箱中冷藏。
此溶液每月配制一次。
注意:
倒入瓶中时要尽量装满！
！
4、考马斯亮蓝G-250的配制（1000mL）
称考马斯亮蓝G-250100mg即0、1g溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%（w/v）考马斯亮蓝G-250,4、7%（w/v）乙醇,8、5%（w/v）磷酸。
5、1、0M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000mL）
名称
分子量Mn
重量（g）
柠檬酸（C6H8O7·H2O）
210
210
NaOH
40
74、5
准确称取柠檬酸210g,溶于约750mL煮沸（10min）蒸馏水中,待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74、5g,完全溶解后将上述溶液转移到1000mL容量瓶中,冷却后将容量瓶定容到1000mL（原始pH4、45）。
（检验方法:
取1、0M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍,测定稀释液的pH值,pH值应为4、8）
6、标准糖溶液的配制与标准方程的测定
（1）标准糖溶液的配制
准确称取2、000g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105℃烘干3h）,蒸馏水溶解,全部转移至1L容量瓶内,摇匀,配制成2g/L葡萄糖/木糖溶液。
取9个100mL容量瓶、1支20mL刻度吸管,分别吸取2g/L葡萄糖/木糖溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL依次加入容量瓶,蒸馏水定容,摇匀。
即为0、2g/L、0、4g/L、0、6g/L、0、8g/L、1、0g/L、1、2g/L、1、4g/L、1、6g/L、1、8g/L、2、0g/L葡萄糖/木糖标准溶液。
取6个30mL容量瓶、1支20mL刻度吸管,分别吸取2g/L葡萄糖溶液10mL、12mL、14mL、16mL、18mL、20mL依次加入容量瓶,每瓶再加入1、5mL柠檬酸缓冲液,蒸馏水定容,摇匀。
即为1、0g、1、2g、1、4g、1、6g、1、8g、2、0g酶解葡萄糖。
（2）标准方程的测定:
葡萄糖/木糖标准方程的测定
取10支25mL刻度管,10支1mL刻度吸管,分别加入0、2g/L、0、4g/L、0、6g/L、0、8g/L、1、0g/L、1、2g/L、1、4g/L、1、6g/L、1、8g/L、2、0g/L葡萄糖/木糖标准溶液1mL,DNS溶液3mL。
100℃煮沸5min,水浴冷却后定容至25mL,摇匀。
以蒸馏水作为空白对照,550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标,C为横坐标,制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为:
A=MC+N,723型分光光度计输出方程为:
C=KA+B）
酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）
取6支25mL刻度管,6支2mL刻度吸管,分别加入1、0g、1、2g、1、4g、1、6g、1、8g、2、0g酶解木糖标准溶液1、5mL,DNS溶液3mL,100℃煮沸5min,水浴冷却后定容至25mL,摇匀。
以蒸馏水作为空白对照,550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标,C为横坐标,制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为:
A=MC+N,723型分光光度计输出方程为:
C=KA+B）
酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）
取6支小试管,6支2mL刻度吸管,分别加入1、0g、1、2g、1、4g、1、6g、1、8g、2、0g酶解葡萄糖标准溶液1、5mL,DNS溶液3mL,100℃煮沸5min,水浴冷却后,量筒定容至50mL（定容至25mL,测定CMC酶活力）,摇匀。
以蒸馏水作为空白对照,550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标,C为横坐标,制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为:
A=MC+N,723型分光光度计输出方程为:
C=KA+B）
7、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制
pH
0、1mol/L
柠檬酸/mL
0、2mol/L
磷酸氢二钠/mL
pH
0、1mol/L
柠檬酸/mL
0、2mol/L
磷酸氢二钠/mL
2、2
19、60
0、40
5、2
9、28
10、72
2、4
18、76
1、24
5、4
8、85
11、15
2、6
17、82
2、18
5、6
8、40
11、60
2、8
16、83
3、17
5、8
7、91
12、09
3、0
15、89
4、11
6、0
7、37
12、63
3、2
15、06
4、94
6、2
6、78
13、22
3、4
14、30
5、70
6、4
6、15
13、85
3、6
13、56
6、44
6、6
5、45
14、55
3、8
12、90
7、10
6、8
4、55
15、45
4、0
12、29
7、71
7、0
3、53
16、47
4、2
11、72
8、28
7、2
2、61
17、39
4、4
11、18
8、82
7、4
1、83
18、17
4、6
10、65
9、35
7、6
1、27
18、73
4、8
10、14
9、86
7、8
0、85
19、15
5、0
9、70
10、30
8、0
0、55
19、45
注:
Na2HPO4,Mr=141、98;0、2mol/L溶液为28、40g/L
Na2HPO4·2H2O,Mr=178、05;0、2mol/L溶液为35、61g/L
C6H8O7·H2O,Mr=210、14;0、1mol/L溶液为21、01g/L
二、酶活力的测定
1、滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力
采用国际理论与应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,T、K、,etal,Pure&Appl、Chem、,1987,59,257-268],一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。
测定方法如下:
取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50mg卷成筒状的滤纸条（1×6cm）,适当稀释酶液,取7支试管按下表操作。
（5#有底物无酶,6#为有酶无底物空白对照）
项目
1#
2#
3#
4#
5#
6#
7#
稀释酶液（mL）
0、2
0、3
0、4
0、5
0
0、5
酶解葡萄糖
标样1、5mL
0、05M柠檬酸缓冲液（mL）
1、3
1、2
1、1
1、0
1、5
1
将上述试管盖上塑料布,用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中,保持在振幅80与温度50℃下保温60min后立即取出加入3mLDNS试剂,在沸水中反应5min,冷却后加水至50mL并充分摇匀,待滤纸完全沉淀后,取上层清液于550nm波长下测定吸光度A值。
反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
以0、2、0、3、0、4、0、5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标,酶量的对数为纵坐标作图,从图中找出生成2mg葡萄糖的酶量,按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）:
滤纸酶活力=2mg葡萄糖
60min×0、18（mg/μmol）×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）
一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量,单位:
IU/mL。
备注:
当加入0、5mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！
）仍无法生成2mg葡萄糖时,按下式计算:
滤纸酶活=0、185×（葡萄糖mg数）
2.β-葡萄糖苷酶活力的测定
方法一:
葡萄糖氧化酶测定法
按国际标准方法测定[Ghose,T、K、,etal,Pure&Appl、Chem、,1987,59,257-268]。
一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位（IU/mL）等于标准条件下每分钟转化1μmol底物即生成2μmol葡萄糖的酶量来表示。
预先用0、05M的柠檬酸缓冲液配制15mmol/L的纤维二糖溶液（0、513g纤维二糖/100mL0、05M的柠檬酸缓冲液,现配现用）
（1）每个样品应做三个不同酶量
估计β-葡萄糖苷酶活力（IU/mL）
<0、1
0、1
0、2
0、3
取酶液量（mL）
0、5/0、8/1、0
0、3/0、5/0、8
0、2/0、3/0、5
0、1/0、2/0、3
（2）加料:
试管中加入酶液、缓冲液与纤维二糖溶液如下:
酶液量
（mL）
0、05M柠檬酸缓冲液（mL）
纤维二糖溶液
（mL）
样品
适量
1－酶液
1
酶液空白
1
1
0
纤维二糖空白
0
1
1
每个试管共2mL,用塑料纸包扎好。
注意:
纤维二糖溶液必须用0、05M柠檬酸配制。
（3）酶解反应:
试管置于50℃水浴中,保温30分钟,取出,沸水中放置5分钟使酶失活,冷却至室温。
（4）加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）:
取试管中冷却液30µL,加入显色剂3、0mL,混匀;同时做一个葡萄糖标样:
取1g/L葡萄糖标样30µL,加显色剂3、0mL,混匀;置于37℃水浴中,保温15分钟,取出。
（5）测吸光度:
505nm,用蒸馏水调零,测各试管溶液吸光度A值。
1g/L葡萄糖标样的吸光度为0、7左右。
（6）计算产生的葡萄糖mg数:
样品吸光度
测得酶空白所含葡萄糖=2×（mg）
纤维二糖空白1g/L葡萄糖标样吸光度
样品实际产生的葡萄糖=[测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]
－[酶空白葡萄糖mg]×[酶液量mL]（mg）
注:
纤维二糖空白所产生的响应值,当纤维二糖溶液为新鲜配制时,一般很低。
（7）作图:
以log（酶液量mL）为纵坐标,实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图,求出生成1mg葡萄糖时对应的酶液量mL。
（8）计算β-葡萄糖苷酶活力:
0、0926
β-葡萄糖苷酶活力=（IU
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