核酸提取常见试剂的作用原理.docx

核酸提取常见试剂的作用原理.docx

《核酸提取常见试剂的作用原理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸提取常见试剂的作用原理.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

核酸提取常见试剂的作用原理

异硫氰酸胍之相礼和热创作

强用力的蛋白量变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的毁坏消散而迅速与核酸分离.胍盐是毁坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常运用的蛋白量变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲形态.含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以构成较强的氢键.在还原剂存在的状况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而往垢剂，如SDS存在的状况下，可以毁坏疏水作用.

盐酸胍、尿素

盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它其实不是一种充足强的变性剂，可以容许完好的RNA从富含RNase的组织中提取出来.

4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：

1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，构成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除往，从而惹起N-D反应均衡向右挪动，随着变性剂浓度添加，自然形态的蛋白不竭变化成复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能构成氢键，当浓度高时，能毁坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质外部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素惹起的变性每每是不成逆的.

高浓度尿素使蛋白量变性并抑制Rnase活性

十二烷基肌氨酸钠

使蛋白质解体变性

巯基试剂

1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境.DTT，DDTE、巯基乙醇运用最广，谷胱甘肽也常运用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放.DNA提取中，常运用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有肯定的毒性，浓度不该高于2%.

巯基乙醇

β-巯基乙醇的次要作用是毁坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）.

1还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性

2抑制酚类氧化，若氧化，核酸会酿成灰黑色，苯酚的氧化产品苯醌等氧化物惹起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联

3呵护蛋白质的巯基蛋白质提取中必要

巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活

化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能毁坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白量变性但不影响肽键和二硫键，不克不及使蛋白质完全变性

加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA完全变性

DTT二硫苏糖醇

刺激性气息要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多.而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些.由于容易被空气氧化，因而DTT的波动性较差；但冷冻保管或在惰性气体中处理可以延伸它的运用寿命.由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的无效还原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不克不及进行高压处理.

抑制Rnase活性

TCEP三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐

半胱氨酸

Trizol

苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等.TRIzol的次要成分是苯酚.苯酚的次要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放.苯酚虽可无效地变性蛋白质，但不克不及完全抑制RNA酶活性，因而TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）.

0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合运用可加强抑制造用.

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白量变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消散，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离.

β-巯基乙醇的次要作用是毁坏RNase蛋白质中的二硫键.

液氮

组织破碎，裂解细胞

SDS

十二烷基硫酸钠

阴离子往垢剂，高温（55-65℃）裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，构成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸，进步盐（KAc或NaAc）浓度并降低温度（冰浴），使SDS/蛋白质/复合物变化成溶解度更小的钾盐酸方式，使蛋白质及多糖杂质沉淀愈加完全、离心后除往沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA

操纵简单，和气，可提取到高分子量的DNA，但产品多糖类杂质较多

阳离子强概况活性剂，通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一同运用

可毁坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

溶解膜类蛋白

SDS能裂解细胞.使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子往污剂可以毁坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸.

（1）SDS是一种阴离子概况活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位;

（2）SDS可惹起蛋白质构象改变

（3）SDS是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性

（4）构成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电

质粒方面：

在1％的SDS溶液中渐渐加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会发生沉淀的.因而高浓度的盐导致了SDS的沉淀.但假如你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多.这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后酿成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因而发生了沉淀.云云看来，溶液III加入后的沉淀实践上是钾离子置换了SDS中的纳离子构成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全.大家晓得SDS特地喜欢和蛋白质结合，均匀两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所发生的大量沉淀自然就将尽大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一同被共沉淀了.基因组DNA一旦发生断裂，只需是50－100kb大小的片断，就没有法子再被PDS共沉淀了

CTAB

CTAB：

十六烷基三甲基溴乙胺，低温时易沉淀

阳离子往污剂

一种在高盐下能和核酸结合构成可溶、波动的复合物，低盐浓度下可沉淀的概况活性剂

是一种阳离子往污剂,低离子强度（0.1-0.5MNaCl），沉淀核酸与酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中.在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖构成复合物，只是不克不及沉淀核酸.经过无机溶剂抽提，往除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

CTAB可从大量发生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA，这种往污剂加入调理至高离子强度的细菌和细胞裂解液中（＞0.7MNaCl），经过连续的酚/氯仿抽提，往除CTAB/黏多糖/蛋白质复合体，异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA分离出来

CTAB还有进步DNA互补链复性速率及波动已构成的DNA双螺旋的作用

CTAB法的次要特点是用用较广

CTAB溶液在低于15度会构成沉淀析出，因而在将其加入冰冷的植物材料时，必须预热，且离心温度不低于15度

EDTA

酶抑制剂，螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶

螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNA

EDTA是往垢剂，结合离子用，而它结合的部分离子是可以诱发或者促进RNA酶活性的，比方Ca2+.EDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是必要依赖二价阳离子的,以是EDTA能经过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性

碱性条件下才可以溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液调理pH.

0.01M，DNase酶基本失活.

BSA

酶抑制剂，使一些降解酶的活性的概况变性

精胺或其他多胺

酶抑制剂，降低核酸酶的影响

氰化物

酶抑制剂，降低重金属氧化酶的影响

PVP

减少酚类、醌类、单宁类物质的影响，抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，往除多糖和色素，色素是PCR强抑制剂，必须往除

样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PVP或PVPP等能络合多酚和萜类物质，离心或氯仿抽提出往，无效防止多酚氧化成醌类，防止溶液变褐色而具有抗氧化才能

提取液中加入过量的PVP或PVPP能进步DNA的纯度，用量根据杂质而定（1-6%），PVP同时能往除多糖，因而将PVP和巯基乙醇配合运用并调整用量，能无效防止多酚净化

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚构成一种不溶的络合物质，无效往除多酚，减少DNA中酚的净化；同时它也能和多糖结合，无效往除多糖.

Triton-x100

Triton X100之类的往垢剂有苯环结构，以是在280nm有很强的吸取.

蛋白酶K

蛋白酶K：

切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完好地分离出来.

蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性（pH4-12.5）温度范围37-60度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些往污剂：

Tween20（5%）、TritonX-100（1%）和SDS（1%）条件下也有活性.

蛋白酶K消化裂解法适用于全部标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞（包含石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部分泌物、尿，粪便等.蛋白酶K的一样平常工作浓度是50—100μg/ml

蛋白酶（蛋白酶K或链酶蛋白酶）可以降解蛋白质,灭活核酸酶（DNase和RNase）,DNase和RNase也用于往除不必要的核酸，有人运用蛋白酶替代DEPC处理水的，但有些人说效果欠好.

蛋白酶K，威力巨大的广谱蛋白酶，95C加热10分钟，则完全失活.数年前初次运用它替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理RNase-Free的水，效果也是一级棒.从此就再也不必DEPC了.配制RNA裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，末了，加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml.悄悄混匀，室温放置15分钟后即可.

枪头及离心管往除RNase：

先将枪头及离心管洗濯干净后，移入事后混好的含1ug/ml蛋白酶K的双蒸水，完全浸入.室温放置30分钟后，连水一同高压灭菌.弃水后，烘干即可.

RNase-Free水的获得：

直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml.悄悄混匀，室温放置15分钟后，灭菌处理即可.该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响.

无蛋白质残留的RNase-Free水的获得：

这比较费事.直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml.悄悄混匀后，倒入公用的蒸馏器中.放置15分钟后，加热蒸馏，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free水.要提示的是，该公用蒸馏器头几次流出来的水，只能当平凡蒸馏水用，由于通道中难确保RNase-Free的环境；另外，肯定要次要密闭性，否则，流出的水又被净化了.

DNA裂解液的作用是毁坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完好地分离出来！

溶菌酶

溶壁酶

Dnase

Rnase

多糖水解酶：

水解多糖

饱和酚

酚是一种无机溶剂,事后要用STE缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸取水相而带走一部分核酸.酚也易氧化发黄,而氧化的酚可惹起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：

故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化.

苯酚

非极性分子水为极性分子

使蛋白量变性，同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联合键已断，蛋白分子概况又含有很多极性基团与苯酚类似相溶.蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相.运用酚的优点：

1.无效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用.能无效使蛋白量变性而出往，酚构成的无机相毁坏蛋白质的胶体波动性，从而蛋白质不会分布在水相中，防止核酸净化

缺陷：

1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA.2.不克不及完全抑制RNase的活性.

酚变性大，但与水相有肯定程度的互溶，大约10-15%的水溶在酚相中，使核酸损失

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用宏大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比方4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到下层，晦气于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以添加比重，使得酚/氯仿一直在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，假如单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比方限定性酶切反应），应此假如单独用酚抽提后肯定要用氯仿抽提一次将水相中的酚往除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不克不及正常进行.至于异戊醇的添加，其作用次要是为了让离心后上下层的界面愈加明晰，也方便了水相的回收.

氯仿

非极性分子水为极性分子

往除脂肪,使更多蛋白量变性,从而进步提取服从

克服酚的缺陷；加速无机相与液相分层.末了用氯仿抽提：

往除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

氯仿变性不如酚好，但与水不混溶，不会带走DNA

因而混合运用最佳，经酚第一次抽提的水相有残留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次带走酚，也可在第二次抽提中混合运用，比例为1：

1

苯酚/氯仿

苯酚、氯仿抽提往除蛋白质

非极性分子水为极性分子，当蛋白水溶液与他们混合时，蛋白质分子见的水分子被挤往，使蛋白失往水合形态而变性，经离心，变性蛋白密度比对大，而与水相分离，苯酚/氯仿比庞大，保存在最下层

苯酚氯仿使蛋白量变性量要充足，由于苯酚往除蛋白是有肯定的饱和度的，超出饱和度，裂解体系中蛋白质不克不及被一次性往除，必须多次抽提.离心后分三层，下层无机层中有一些脂溶性的杂质，两头层白色絮状沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸；变性后的蛋白质从水相中析出，位于苯酚中或苯酚与水相之间.

异戊醇

抽提DNA，为混合均匀，容易发生气泡，气泡会制止互相间的充分作用，加入异戊醇降低分子概况张力，一样平常采取氯仿：

异戊醇=24：

1或酚：

氯仿：

异戊醇=25：

24：

1（不必先设置，临用前加入即可）

减少操纵过程中发生的气泡.

减少蛋白量变性操纵过程中发生的气泡.异戊醇可以降低概况张力，从而减少气泡发生.另外，异戊醇有助于分相，使离心后的下层含DNA的水相、两头的变性蛋白相及下层无机溶剂相维持波动.

NaCl

提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相

沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是毁坏能使蛋白质坚持波动的两个要素,使蛋白和DNA分离并沉淀上去.而此时盐的阳离子会与DNA结合构成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀上去

提取DNA时先加0.14mol/L氯化钠，由于在这种浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白质的溶解度添加，这样经过过滤能将DNA分离开，以除往蛋白质.再加入95%的酒精能使DNA沉淀，由于在这个浓度下DNA溶解度最低.假如直接加酒精不先加氯化钠，DNA和蛋白质都能被酒精所沉淀，就无法将DNA和蛋白质分离开.以是必须先加氯化钠后加酒精，顺序不克不及颠倒.

DNA溶液是DNA以水合形态波动存在，当加入乙醇时，乙醇会夺往DNA四周的水分子，使DNA失水而易于聚合.这样可以是DNA沉淀出来在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加肯定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的异性电荷相斥力，易于互相聚合而构成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只要部分DNA构成DNA钠盐而聚合，这样就形成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也欠好.在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必需要进行洗濯或重沉淀.

柠檬酸钠

它可以操纵反应体系的离子强度，同时还有肯定的缓冲作用，包管体系PH的绝对波动形态，总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂.

DEPC

焦碳酸二乙酯，它经过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白量变性，从而抑制酶的活性.与肝素何用效果加强.在Tris中不波动，很快会分解为二氧化碳和乙醇.

猛烈但不完全的RNA酶抑制剂0.1%浓度

Tris-HCl

缓冲体系，使pH变更不会太大

异丙醇

加入异丙醇之后马上出现絮状沉淀，我不停以为这是正确的，看了帖子才晓得是蛋白质净化，

异丙醇的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好，但是异丙醇沉淀有一个弊病就是会沉淀上去好多的盐和蛋白质这样会影响下一步的操纵，一样平常我加异丙醇是等体积的效果还可以.

70%乙醇

70%乙醇洗濯DNA沉淀（由于在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶）,用无水乙醇则达不到这个目的!

乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白质碎片是可以溶于75%乙醇的.漂洗DNA，是为了往除残存的盐类，往除过量SDS和酚等杂物，由于SDS在70%的乙醇中坚持溶解形态，不与DNA共沉淀，从而经过弃上清液往除这种往污剂,防止对当前PCR反应的影响.

DEPC

（焦碳酸二乙酯）:

经常运用RNA酶抑制剂，与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白量变性,猛烈但不完全的RNA酶抑制剂

甲酰胺

用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的蛋白酶K消化物中分离抽提DNA，甲酰胺是一种离子化溶剂，能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，因其不影响蛋白酶K的活性，特别适于分离高分子质量的DNA，其分离物籍火棉胶袋的透析，往除变性蛋白进而纯化DNA.

聚乙二醇PEG

无机聚合物，无毒，亲水性强，绝对分子量6-20k，沉淀效果次要与其本人的浓度和分子量有关，同时受离子强度、溶液pH值和温度等要素的影响，采取该方法可将病毒稀释10倍以上.为一种非离子多聚物，多离子多聚物是六十年代进展起来的一类紧张沉淀剂.基于多聚物的沉淀作用次要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小，Laurent等（1967）提出PEG的沉淀机理次要是经过空间地位排挤，使液体中的微粒（包含生物大分子、病毒和细菌等）自愿集聚在—起而惹起沉淀的发生.PEG最早运用于提纯免疫球蛋白（IgG）和沉淀一些细菌病毒，今年来逐步运用于核酸和酶的分离纯化，特别是用PEG分离质粒DNA，已相当普遍.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA，可以在500ulDNA液中加入200ul20％PEG8000（含1．2mol／LNaCl），冰浴20min（Lieta1．，1994）.该操纵的优点在于：

操纵条件和气，不容易惹起生物大分子的变性.同时具有极高的沉淀效能，大批的PEG可以沉淀相当多的生物大分子.

乙基黄原酸钾

乙基黄原酸钾可以与多糖结合，构成可溶性复合物，使细胞壁决裂，释放出核酸.此复合物在铵离子存在的状况下可变化成水不溶性，并可经过简单的离心除往，不必要苯酚或氯仿抽提.另外，乙基黄原酸钾可以结合金属离子，抑制DNase的活性.Tillett等（2000）利用该方法从蓝细菌、微生物、环境样品中提取到高质量的核酸，DNA可以用于酶切、克隆、PCR，RNA可以用于RT-PCR，Southern杂交等反应，而且样品中不含核酸酶，温育16h没有发生降解.