备战高考考点一遍过考点75蛋白质的提取与分离生物解析版.docx

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备战高考考点一遍过考点75蛋白质的提取与分离生物解析版

1．蛋白质提取与分离的依据

分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。

2．凝胶色谱法

（1）材料：

凝胶

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（2）步骤：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

原理：

当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3．缓冲溶液

（1）概念：

在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。

（2）作用：

能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。

（3）配制：

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。

调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。

如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。

（4）本实验使用的是磷酸缓冲液（NaH2PO4/Na2HPO4），目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。

4．电泳法

（1）概念：

指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

（2）原理：

分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（3）类型：

琼脂糖凝胶电泳法：

由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法：

在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。

5．实验操作

实验操作的基本步骤：

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

（一）样品处理

（1）红细胞的洗涤：

①目的：

去除杂蛋白。

②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。

③所用洗涤液：

是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。

④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。

⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

（2）血红蛋白的释放：

在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：

（方法）离心。

试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：

①无色透明的甲苯层。

②白色薄层固体：

脂溶性物质沉淀层。

③红色透明液体：

血红蛋白溶液层。

④暗红色沉淀层：

红细胞破碎物沉淀。

（4）透析：

①方法：

取1mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12h。

②目的：

去除样品中分子量较小的杂质。

③原理：

透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

（二）凝胶色谱操作

（1）凝胶色谱柱的制作

制作步骤：

打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管。

（2）凝胶色谱柱的装填

①材料：

实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。

②方法：

凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。

不能有气泡存在。

然后用300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。

（3）样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。

待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

考向一蛋白质提取与分离的方法及原理

1．下列有关提取和分离血红蛋白实验的叙述，错误的是

A．该实验的材料必须选用鸡血

B．通过透析法可以去除样品中相对分子质量较小的杂质，此为样品的粗提取

C．凝胶色谱法是利用蛋白质的相对分子质量的大小分离蛋白质

D．电泳法是利用各种分子带电性质的差异及分子的大小差异分离蛋白质

【参考答案】A

2．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是

A．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中

B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快

C．将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内

D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远

【答案】A

考向二蛋白质提取与分离的实验操作

3．红细胞中含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。

下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是

A．血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行

B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液

C．样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白

D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定

【参考答案】B

【试题解析】血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行，A正确；纯化过程中要用缓冲溶液充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液，B错误；样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白，C正确；可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，D正确。

易错警示

1．红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2．色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

3．凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。

4．色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。

4．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。

请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

（1）将实验流程补充完整：

A为________，B为________。

凝胶色谱法是根据____________而达到蛋白质分离的有效方法。

（2）洗涤红细胞的目的是去除_________，洗涤次数过少，无法除去_________；离心速度过高和时间过长会使_______一同沉淀，达不到分离的效果。

洗涤干净的标志是__________。

释放血红蛋白的过程中起作用的是______________。

（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是__________。

如果红色区带____________，说明色谱柱制作成功。

【答案】

（1）血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小

（2）杂蛋白（血浆蛋白）血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯

（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动

【解析】

（1）血红蛋的提取与分离的实验步骤主要有①样品处理：

红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析；②粗分离；③纯化：

凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的装填→样品的加入和洗脱；④纯度鉴定——聚丙烯酰胺胶电泳。

所以A表示血红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱。

凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

所以凝胶色谱法是根据相对分子质量大小而达到蛋白质分离的有效

1．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的

A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离

B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质

C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质

D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质

2．蛋白质提取过程中有关透析的叙述，错误的是

A．用于透析的薄膜要具有选择透过性

B．透析膜一般是用硝酸纤维素制成的

C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内

D．透析可用于更换样品的缓冲液

3．下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是

A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法

B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出

C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系

D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来

4．将处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是

A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层

B．甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层

C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层

D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层

5．为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是

A．要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠

B．取血回来后，马上进行高速长时间离心

C．将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌

D．重复洗涤直到上清液呈红色为止

6．相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶色谱柱中的行进过程，可表示为图中哪一个

A．

B．

C．

D．

7．下列有关血红蛋白的提取与分离的实验操作的叙述，正确的是

A．分离红细胞时采用低速长时间离心

B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可

C．分离血红蛋白溶液要低速短时间离心

D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h

8．镰刀型细胞贫血症是一种由基因突变引起的遗传病，患者的红细胞是弯曲的镰刀状。

这样的红细胞容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。

某科学兴趣小组计划从血红蛋白的成分是否变化来开展研究性学习。

下列是该小组成员获得纯度很高的血红蛋白的实验过程，不正确的一项是

A．对红细胞进行洗涤，在加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液静置一段时间后分层获得血红蛋白溶液

B．将血红蛋白溶液装入透析袋中透析，可达到粗分离的目的

C．利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化

D．使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获得纯度很高的血红蛋白

9．如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置。

请据图回答下列问题：

（1）血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质的______________功能。

（2）甲装置用于____，目的是__________________。

用乙装置分离蛋白质的方法叫____，是根据__________分离蛋白质的有效方法。

（3）甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____；乙装置中，C溶液的作用是__________________。

（4）用乙装置分离血红蛋白时，待___________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

10．红细胞内含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。

请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：

________、粗分离、纯化和________。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行处理、离心后，收集血红蛋白溶液。

以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、____________________、____________________。

（3）收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是________。

然后通过________将样品进一步纯化，最后经________进行纯度鉴定。

（4）如图是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入和洗脱示意图。

请据图回答下列问题。

①在加样品示意图中，正确的顺序是___________________。

②用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是______________、______________、________________。

③待________________时，才加入缓冲溶液。

④待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。

1．【答案】A

【解析】蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，A项错误。

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现蛋白质分子的分离，B项正确。

凝胶色谱法的原理是：

分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快，而分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢，所以可以根据蛋白质相对分子质量的大小，通过凝胶色谱法使大分子的蛋白质先洗脱出来，小分子的蛋白质后洗脱出来，从而实现蛋白质分子的分离，C项正确。

根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的蛋白质分子位于不同层次的离心液中，从而实现蛋白质的分离，D项正确。

2．【答案】A

3．【答案】C

【解析】凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小决定了被分离的物质分子的运输路径，从而实现了物质的分离，C错误。

4．【答案】D

【解析】将处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层，D正确。

5．【答案】A

【解析】为了防止血液凝固，要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，A正确；取血后，应进行低速短时间离心，B错误；离心后的血细胞加入蒸馏水和40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌，使红细胞破裂，C错误；红细胞重复洗涤直到上清液不再呈现黄色为止，D错误。

6．【答案】B

【解析】相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确。

7．【答案】D

【解析】分离红细胞应采用低速短时间离心，防止白细胞与红细胞一同沉淀，A错误；红细胞释放血红蛋白，需加入蒸馏水和40%体积的甲苯，再在磁力搅拌器上充分搅拌10min，B错误；分离血红蛋白要高速长时间离心，C错误；透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h，D正确。

8．【答案】A

9．【答案】

（1）运输

（2）透析（粗分离）去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小

（3）磷酸缓冲溶液洗脱血红蛋白

（4）红色的蛋白质接近色谱柱的底端

【解析】

（1）血红蛋白具有运输O2的作用，体现了蛋白质的运输功能。

（2）甲是透析装置，用于透析，其目的是去除样品中相对分子质量较少的杂质，使大分子蛋白质保留在袋中。

乙是利用凝胶色谱法分离蛋白质的装置，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

（3）甲所示的透析装置中，透析袋内的B是血红蛋白溶液，则透析袋外的A是磷酸缓冲溶液。

乙装置中的C为缓冲溶液，其作用是洗脱血红蛋白。

（4）由于血红蛋白带有红色，当红色的蛋白质接近色谱柱的底端时，用试管收集血红蛋白，每5mL收集一管，连续收集。

10．【答案】

（1）样品处理纯度鉴定

（2）血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液

（3）透析凝胶色谱法SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（4）①④→①→②→③②不能破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动③样品完全进入凝胶层③红色的蛋白质5

【解析】

（1）血红蛋白的提取和分离一般分为四步：

样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

（2）样品处理包括红细胞洗涤、血红蛋白释放、分离血红蛋白溶液和透析四步。

（3）收集的血红蛋白溶液要通过透析的方法进行粗分离；样品的纯化是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，最后