木香川木香土木香青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定.docx

木香川木香土木香青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定.docx

《木香川木香土木香青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《木香川木香土木香青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

木香川木香土木香青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定

木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定

　　[摘要]通过分析木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材的ITS2（internaltranscribedspacer2）条形码序列，探讨木香类药材鉴定新方法。

对60份样品提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，所得序列经CodonCodeAligner拼接后，采用MEGA5.0软件进行序列比对，计算种内和种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joingtree，NJTree）。

结果表明，无论是菊科的木香、川木香、土木香，还是马兜铃科的青木香和五味子科的红木香，ITS2序列种内变异均小于种间变异，ITS2序列所有单倍型比对后长度为272bp，变异位点达到162个；遗传距离显示物种种内平均K2P远远小于种间平均K2P；NJ树结果显示木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材可明显区分，且能鉴别川木香的2个基原物种。

因此，ITS2序列可用于鉴定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材，为临床安全用药提供依据。

　　[关键词]DNA条形码；物种鉴定；ITS2序列；菊科；马兜铃科；五味子科

　　木香、川木香、土木香、青木香、红木香5种木香类药材由于药材外形、气味、功效相似或者存在同名异物或同物异名等原因容易混淆，造成鉴定困难，但是这5种木香药材来源于不同的基原植物，木香AucklandiaeRadix为菊科Asteraceae植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根，又称为广木香或云木香；川木香VladimiriaeRadix为菊科植物川木香Vladimiriasouliei（Franch.）Ling、灰毛川木香V.souliei（Franch.）Lingvar.cinereaLing的干燥根；土木香InulaeRadix为菊科植物土木香InulaheleniumLing.的干燥根，又称为青木香或祁木香；青木香AristolochiaeRadix为马兜铃科Aristolochiaceae植物马兜铃AristolochiadebilisSieb.etZucc.的干燥根；红木香KadsuraeRadix为五味子科Schisandraceae植物南五味子KadsuralongipedunculataFinetetGagnep.的干燥根，又称土木香[1-3]。

　　木香类药材用药历史悠久，但5种木香类药材出现混用、替代，造成市场上木香类药材混乱。

木香是常用药材，从梁代开始经广州进口的舶来品，称广木香，因其质量较优，逐渐成为主流品种。

后在云南引种成功，称云木香，是现存木香药材的主流品种[4]，具有行气止痛、健脾消食的功效[1]。

现代药理研究表明木香对消化系统、心血管系统、呼吸系统以及多种肿瘤细胞有确切的疗效[5-9]。

川木香是原产我国的道地药材，主产于四川西部，曾是木香的代用品和地方习用品[3-4]。

川木香药材的功效与木香相似但侧重不同，药典中单独收载，应区别应用。

但是川木香、灰毛川木香与木香主要有效成分均为去氢木香内酯、木香烃内酯，研究表明三者的指纹图谱，气相色谱相似度很高[10-13]，不易区分。

Shum等[14]也通过GS-MS分析木香、川木香和灰毛川木香等物种挥发油成分，聚类分析表明可以区分木香与混伪品，但检测方法复杂，且无法区分川木香和灰毛川木香。

土木香也曾作为木香的代用品[3-4]，土木香与木香的化学成分差异较大，其主要药效成分为土木香内酯和异土木香内酯，具有健脾和胃、行气止痛、安胎的功效[1]，现已取代马兜铃科青木香。

2010年版《中国药典》仅收载木香、川木香、土木香3种木香类药材，其他的木香类药材已不予收载。

青木香起始作为木香代用品种出现[4]，但现代研究表明马兜铃科植物中含有马兜铃酸，能引起肾毒性不良反应[15-16]，已于2004年取消青木香药品标准，凡中成药处方中含有青木香的药材将用土木香I.heleniumL.干燥根代替。

红木香是木香的混淆品，性味功能与木香差异大，性温、味辛，有行气、活血、止痛的功效[3]。

总的来说，木香类药材原始品种、地方习用品、代用品和混淆品种类繁多，情况复杂，通过传统方法鉴定或化学成分检测不能很好的进行区分，不利于木香类药材规范化安全用药，需要寻找一种快速、准确的分子鉴定方法，以确保临床安全用药。

　　DNA条形码技术具有较强通用性，作为物种鉴定新手段，倍受国内外研究者关注[17-23]，目前，DNA条形码分子鉴定指导原则已经获准纳入《中国药典》2010年增补本[24]。

Chen等[25]提出ITS2序列可以作为标准DNA条形码鉴别药用植物及其近缘物种。

ITS2片段具有适合扩增和测序的长度，在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，因此，在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。

Yao等[26]基于大样本量分析证实ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码。

本文应用ITS2序列对5种木香药材进行鉴定，为临床安全用药提供依据。

　　1材料

　　木香药材样品（根）来源于云南、四川、西藏，包括药材市场购买、药店购买、野生采挖共20份；叶片样品1份，来源于云南。

川木香药材样品（根）6份，灰毛川木香药材样品（根）16份，来源于主产区四川，包括野生采挖、药材市场购买；川木香叶片样品1份，来源于中国医学科学院药用植物研究所1961年标本，灰毛川木香叶片样品1份，来源于中国医学科学院药用植物研究所1974年标本；土木香药材样品（根）11份，来源于西藏，包括药材市场购买、野生采挖；叶片样品1份，来源于河南南阳。

马兜铃药材样品（根）2份，来源于江西；叶片样品1份，来源于四川成都；木香3条ITS2序列，南五味子3条ITS2序列均由GenBank下载的ITS序列剪切而来。

研究样本经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员和成都中医药大学国锦林教授鉴定，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。

实验材料详见表1。

　　2方法

　　木香、川木香、土木香和马兜铃的干燥根均用75%乙醇擦拭药材表面后，刮去外表皮，取根的内部约45mg，用DNA提取研磨仪（RetschMM400，Germany）研磨2min（30次/s）后，水浴56℃8～12h。

利用植物基因组DNA提取试剂盒（TiangenBiotechCo.，China）提取总DNA。

提取过程中，氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次，沉淀DNA步骤时，用-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，摇匀，放入-20℃冰箱冷冻30min，用50μL水洗脱。

叶片的DNA提取方法完全按照Chen等[25]研究的方法。

PCR扩增、测序引物正向ITS2F为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向ITS3R为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[25]。

PCR反应体积为25μL，体系内包含PCRmix12.5μL，2.5μmol?

L-1引物各1μL，模板DNA约20～100ng。

扩增程序：

94℃变性5min；再进行40个循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s）；最后72℃延伸10min[25]。

PCR扩增产物经纯化后，使用ABI3730XL测序仪进行双向测序。

测序峰图利用CodonCodeAlignerV3.7.1（CodonCodeCo.，USA）校对拼接，去除引物区。

对拼接后得到的序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段即可获得ITS2间隔区序列[27]。

然后，将所有序列用软件MEGA5.0分析比对[28]，并基于K2P模型进行遗传距离等分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。

　　3结果

　　3.1木香、川木香、土木香、青木香、红木香种内种间序列特征分析

　　3.1.1种内变异分析木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃、南五味子ITS2序列比对后的长度，GC含量平均值和变异位点个数等信息见表2。

木香种内不同来源样品21条ITS2序列长度均为223bp，分为2个单倍型（表1），单倍型A1包含18条ITS2序列，与3条GenBank序列相同，单倍型A2序列包含2条，在195位点有C-G变异。

川木香种内7条ITS2序列长度为223bp，分为2个单倍型（表1），其中单倍型B1序列包含2条，在8位点有C-T变异，162位点有A-G变异。

灰毛川木香17条ITS2序列比对后长度为223bp，仅有1个单倍型，无变异位点。

土木香12条序列比对后长度为228bp，无变异位点，GC含量在6个物种中最低。

马兜铃3条ITS2序列比对后长度为264bp，分为2个单倍型（表1），单倍型E1包含1条，单倍型E2序列2条，在47位点有T-A变异，GC含量最高达到78%。

南五味子JF976709和JF976710序列相同，JF976712在109位点有G-A变异。

　　3.1.2种间变异分析木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃、南五味子种间ITS2序列两两比对后的长度和变异位点个数见表3。

木香与其他木香ITS2序列比对长度范围为223～264bp，变异位点范围为13～104个，与川木香和灰毛川木香差异小，与马兜铃差异最大。

川木香和灰毛川木香序列比对后，变异位点为2个，种间差异最小。

土木香与马兜铃种间差异最大，变异位点达到115个。

木香、川木香、土木香、青木香、红木香ITS2序列比对长度272bp，变异位点162个，见图1。

　　3.2木香、川木香、土木香、青木香、红木香种内种间遗传距离分析

　　3.2.1种内遗传距离分析基于K2P模型计算遗传距离，ITS2序列种内种间平均K2P距离见表4。

木香ITS2序列种内平均K2P距离为0.001，种内最大K2P距离为0.004；川木香ITS2序列种内平均K2P距离为0.004，种内最大K2P距离为0.009；灰毛川木香和土木香种内K2P距离为0；马兜铃3条ITS2序列种内平均K2P距离为0.003，种内最大K2P距离为0.004；南五味子种内平均K2P距离为0.003，种内最大K2P距离为0.004。

　　3.2.2种间遗传距离分析木香与其他木香药材ITS2序列种间平均K2P距离为0.176，种间最小K2P距离为0.047，大于种内最大K2P距离；土木香与其他木香药材ITS2序列种间平均K2P距离为0.298，种间最小K2P距离为0.247，大于种内最大K2P距离；马兜铃和南五味子与其他木香药材ITS2序列种间平均K2P距离分别为0.748，0.705；川木香和灰毛川木香与其他木香药材ITS2序列种间平均K2P距离分别为0.134，0.158，而川木香和灰毛川木香种间K2P距离为0.005，小于种内最大距离。

　　3.3木香、川木香、土木香、青木香、红木香邻接树（NJ树）鉴定

　　为了更直观的显示鉴定结果，本文基于ITS2序列构建了木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和马兜铃NJ树，见图2，结果表明木香与土木香，马兜铃和南五味子各自聚为一支。

川木香和灰毛川木香形成1个独立支，川木香聚在2个小枝上，与灰毛川木香区分开，因此ITS2作为条形码可准确区分木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和马兜铃。

　　4讨论

　　ITS2条形码序列能够准确且稳定的鉴定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材。

基于ITS2条形码序列构建的NJ树和种内种间遗传距离分析，首次证实ITS2条形码序列能够准确的鉴定并区分5种木香药材，同时也能准确的区分川木香的2个基原植物。

Chen等[29]利用分子技术鉴定木香与相关物种，但所使用是非通用引物，有一定局限性，不适宜推广，而DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定，该方法易于统一、标准化，是中药分子鉴定方法学上的创新[23]。

川木香和灰毛川木香是菊科同属植物，传统形态学鉴定通过叶片背部绒毛区分，对于商品药材鉴定就更加困难，Shum等[14]也利用GS-MS聚类分析川木香和灰毛川木香的挥发油成分，结果显示未区分开。

本文中利用ITS2条形码序列对川木香和灰毛川木香进行鉴定，为二者的鉴定提供新的方法和依据。

　　另外，本研究证实ITS2序列作为鉴定木香类药材有很好的稳定性。

对木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃和南五味子6个物种种内变异分析表明，6个物种ITS2序列种内平均K2P距离均较小，种内遗传变异小。

从木香、川木香、灰毛川木香和土木香基原叶片获得ITS2条形码序列的单倍型与药材获得的单倍型一致。

从木香药材获得的单倍型与GenBank提交的木香ITS2序列比对后，发现本研究采集的木香药材DNA条形码单倍型全部涵盖GenBank提交序列。

　　本研究中川木香叶片样本为1961年标本，灰毛川木香叶片样本为1974年标本，采用叶片提取方法进行DNA提取，尽管年代久远，DNA降解严重，但ITS2条形码具有序列长度短和鉴定效率高的特点，仍能稳定获得ITS2条形码序列，证实ITS2序列在鉴定年代久远的标本上具有明显的优势。

　　木香、川木香、灰毛川木香和土木香药材中的化学成分主要为挥发油，多糖和酚类含量少，所以在DNA提取中较为容易，主要注意以下几点：

①由于这4种木香的药用部位是根部，根部的DNA含量比较少，尤其是储存时间长的商品药材，其DNA含量降解严重，所以需要适当的加大取样量，以达到PCR扩增的DNA浓度，在本研究中经过多次筛选发现取样量约45mg的效果较好；②适当的延长水浴时间，有利于细胞裂解，DNA溶出，本实验发现56℃水浴8～12h效果较好；③沉淀DNA步骤时，用-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，摇匀，放入-20℃冰箱冷冻30min，使DNA能够充分的沉淀；④注意真菌污染的问题，由于ITS2片段在植物和真菌中广泛存在，若药材表面被真菌污染，在PCR时会存在将真菌的ITS2序列扩增出来的可能性。

木香类药材是以根入药，与土壤中的真菌接触，需要进行清洁并削去外皮，取内部组织。

另外，为了考察获得序列的正确性，作者将序列与GenBank数据库进行比对显示序列均为正确序列，不存在真菌污染。

　　在植物的ITS2条形码序列中，种内变异广泛存在，不同植物ITS2序列中种内遗传变异的丰富程度不同，例如在蓼科植物唐古特大黄的ITS2片段中存在丰富的种内遗传变异[30]，而五加科植物人参的ITS2序列中仅存在1种单倍型[31]。

Song等[31]研究表明尽管植物ITS2序列中种内变异频繁，但在大多数情况下，ITS2序列的主要变异能够准确鉴定物种。

为验证文中建立的基于ITS2条形码序列鉴定的准确性和可靠性，特从北京某药店购买木香、川木香和土木香药材，每种药材随机取2个样本，由分类学家初步鉴定药材正确，然后基于本研究建立的方法成功提取DNA，实验结果证实木香的2份样本均为木香，ITS2序列类型为A1；土木香的2份样本均为土木香，ITS2序列类型为D1；川木香的2份样本为灰毛川木香，ITS2序列类型为C1。

本研究不仅解决了不具备分类背景知识的操作人员鉴定难题，也解决了传统鉴定和化学鉴定对木香类药材鉴定中的困难，并能准确鉴定到物种，使木香类药材鉴别方法简便易行，为临床安全用药提供可靠依据。

　　[参考文献]

　　[1]中国药典.一部[S].2010.

　　[2]中国药典.一部[S].2000：

154.

　　[3]王绪颖，贾晓斌，陈彦.木香类药材的研究进展[J].中药材，2010，33

（1）：

153.

　　[4]孙守祥.木香药材历史沿革中的基原变迁与分化[J].中药材，2008，31（7）：

1093.

　　[5]王小英.木香对大鼠实验性急性胃粘膜损伤的影响[J].中医研究，2004，17

（2）：

21.

　　[6]韩坚，林煌权，钟志勇，等.木香超临界提取物抗实验性胃溃疡的研究[J].中药材，2005，28（11）：

1017.

　　[7]侯鹏飞，陈文星，赵新慧，等.木香挥发性成分气质联用分析及其抑制血小板聚集作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（7）：

26.

　　[8]沈映君.中药药理学[M].北京：

人民卫生出版社，2000：

553.

　　[9]LeeMG，LeeKT，ChiSG，etal.CostunolideinducesapoptosisbyROSmediatedmitochondrialpermeabilitytransitionandcytochromeCrelease[J].BiolPharmBull，2001，24（3）：

303.

　　[10]王永兵，许华，王强，等.RP-HPLC法测定川木香中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量[J].西北药学，2000，15（6）：

250.

　　[11]孟青，郭晓玲，詹靖，等.木香CO2超临界萃取物中木香烃内酯、去氢木香内酯的鉴别与含量测定[J].广东药学院学报，2001，17（4）：

284.

　　[12]刘圆，彭镰心，刘超，等.木香、川木香、土木香的高效液相色谱指纹图谱鉴别[J].药物分析杂志，2006，26（11）：

1574.

　　[13]胡晓炜，徐爱仁.三种木香的气相色谱法鉴别与系统聚类分析[J].中国现代应用药学杂志，2005，22（3）：

249.

　　[14]ShumKC，ChenF，LiSL，etal.AuthenticationofRadixAucklandiaeanditssubstitutesbyGC-MSandhierarchicalclusteringanalysis[J].JSepSci，2007，30：

3233.

　　[15]ChenSM，FanMY，TsengCC，etal.Pharmacokineticsandnephrotoxicityofaristolochicacidinrabbits[J].Toxicon，2007，50：

180.　　[16]WenYJ，SuT，TangJW，etal.CytotoxicityofphenanthrenesextractedfromAristolochiacontortainhumanproximaltubularepithelialcellline[J].NephronExpNephrol，2006，103：

e95.

　　[17]LiDZ，LiuJQ，ChenZD，etal.PlantDNAbarcodinginChina[J].JSystEvol，2011，49：

165.

　　[18]KressWJ，WurdackKJ，ZimmerEA，etal.UseofDNAbarcodestoidentifyfloweringplants[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102：

836.

　　[19]SongJY，YaoH，LiY，etal.AuthenticationofthefamilyPolygonaceaeinChinesepharmacopoeiabyDNAbarcodingtechnique[J].JEthnopharmacol，2009，124（3）：

434.

　　[20]辛天怡，姚辉，罗?

j，等.羌活药材ITS/ITS2条形码鉴定及其稳定性与准确性研究[J].药学学报，2012，47（8）：

1098.

　　[21]韩建萍，李美妮，罗?

j，等.DNA条形码鉴定洋金花及其伪品[J].药学学报，2011，46（11）：

1408.

　　[22]陈士林，郭宝林，张贵君，等.中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（8）：

1043.

　　[23]陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：

人民卫生出版社，2012：

4.

　　[24]陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志，2013，38

（2）：

141.

　　[25]ChenSL，YaoH，HanJP，etal.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].PLoSONE，2010，5：

e8613.

　　[26]YaoH，SongJY，LiuC，etal.UseofITS2regionastheuniversalDNAbarcodeforplantsandanimals[J].PLoSONE，2010，5：

e13102.

　　[27]KellerA，SchleicherT，SchultzJ，etal.5.8S-28SrRNAinteractionandHMM-basedITS2annotation[J].Gene，2009，430：

50.

　　[28]TamuraK，PetersonD，PetersonN，etal.MEGA5：

molecularevolutionarygeneticsanalysisusingmaximumlikelihood，evolutionarydistance，andmaximumparsimonymethods[J].MolBiolEvol，2011，28：

2731.

　　[29]ChenF，ChanHYE，WongKL，etal.AuthenticationofSaussurealappa，anendangeredmedicinalmaterial，byITSDNAand5SrRNAsequencing[J].PlantaMed，2008，74：

889.

　　[30]MaXC，XieCX，GuanM，etal.HighlevelsofgeneticdiversitywithinonepopulationofRheumtanguticumontheQinghai-TibetPlateauhaveimplicationsforgermplasmconservatio[J].PharmCrops，2014，5：

1.

　　[31]SongJY，ShiLC，LiDZ，etal.Extensivepyrosequencingrevealsfrequentintra-genomicvariationsofinternaltranscribedspacerregionsofnuclearribosomalDNA[J].PLoSONE，2012，7（8）：

e43971.

　　MolecularidentificationofAucklandiaeRadix，VladimiriaeRadix，

　　InulaeRadix，AristolochiaeRadixandKadsurae

　　RadixusingITS2barcode

　　MAXia