HE常规切片的规范化操作.docx

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HE常规切片的规范化操作

HE常规切片规范化操作

浙江大学附属第一医院病理科xx

病理诊断学发展到今天，出现了大量的辅助诊断手段，但最重要的还是HE切片。

由于HE切片是一个传统而又经典的方法，步骤相同，所以很多人会觉得没什么好学的，其实每个人在具体操作过程中，多多少少会有一点不相同之处，正是由于这一点不相同之处，才使得切片质量各有千秋，这就是所谓的经验。

随意性大，质量不稳定。

病理技术有很多小窍门，有的是在牺牲制片质量的前提下发明的，使用者往往自己不清楚。

各个地方的操作方法不同，习惯不同，最终导致制片质量各不相同。

能做一张优质的HE切片并不难，难的是做好所有的切片。

一个细小的环节出现问题，便会影响以后的所有步骤。

1、取材

取材的好坏，直接影响切片的质量。

在一个规范的实验室，大部份的切片质量问题都是因为取材不好造成的。

医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以

0.2～

0.3cm为适，大块癌组织、脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。

在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。

小标本取材时要注意包埋纸的质量，尽可能选择象桃花纸、包茶叶纸等透水性好的纸张，包时不要双层、多层或折叠层数太多，也不要把过多的组织放在一起，影响脱水液的浸透。

特别要注意新鲜组织取材，组织容易粘在包埋盒壁上，导致固定、脱水不佳。

如果有可能，应选择剖开固定24小时后再取材。

2.固定

固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。

所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。

固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。

另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加了组织的韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。

所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍以上。

固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。

最常用的固定液为10％福尔马林（甲醛）。

福尔马林渗透性强，固定均匀，组织收缩小，但经酒精脱水后收缩较大。

甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。

甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。

由于10％福尔马林受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入水分的影响，浓度容易被降低，导致组织固定不足；而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。

所以可以适当的增加福尔马林的浓度，以12％左右为佳。

pH

7.0中性缓冲福尔马林对大多数抗原有很好的保存作用，而非中性缓冲福尔马林略差，通过大量实验证明，二者有差异，但并不十分明显，通过对抗原修复液、检测系统和修复方法的不同选择，可以缩小二者的差异。

由于HE染色时细胞核的最佳着色点pH为

3.5～

4.5,中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰。

而病理诊断，主要还是以HE切片为主，就常规HE规范化而言，用酸性福尔马林比中性福尔马林要好，每95毫升12％的福尔马林液内加入5毫升的冰醋酸。

但从规范和全面角度出发，还是应该使用中性缓冲福尔马林。

当然如果根据常规切片、免疫组织化学和分子生物学的需要不同选用二种或二种以上不同的固定液分开制片是最好的解决办法。

骨髓应该选择用Bouin液固定24-48小时，如果脱钙不够，可用10%盐酸再脱2-4小时，然后流水冲洗4小时。

送检来的大器官应及时切开固定，大标本取材后（2cm厚）固定时间需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时；当室温低18℃时，应在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。

目前，环保固定液大部份是醇性固定液，对免疫组化结果有一定的影响，乳腺癌诊治规范明确规定不能用醇性固定液，由于我们的诊断标准都是根据10%中性缓冲福尔马林制定的，因此，我们应该慎用。

3.水洗

固定后应该水洗（10～20分钟），这一步通常被很多人所忽视，固定后不水洗，容易造成脱片和染色不鲜艳。

也不利于蜡块内抗原的长期保存。

4.脱水

所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。

脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明。

一般我们总认为脱水主要跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实75-80%浓度的酒精具有极强的穿透力，在短时间内可以置换出大量的水份，而高酒精容易使蛋白质凝固，在组织的表面形成一层硬壳，使酒精难以渗透到组织块中间去，导致组织脱水不佳；其实高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，如果脱水时加温过高（超过35-50℃），使用丙酮等等，都容易导致组织收缩过度和组织发硬、发脆。

组织脱水引起的组织发脆有三种原因：

一种是初始脱水液浓度过高引起组织质地发生改变、硬化；第二种是组织本身质地细腻有关，如小动物肝脏；第三种是假脆（也是组织发脆最主要原因），是由于的脱水不足，组织在浸蜡时蜡无法渗透到组织中去，组织在高温下“干烤”导致发硬、发脆，切片会出现粉粉的或一丝丝的现象，子宫肌瘤等较硬的组织还会一棱棱的现象，甚至会整块往外崩；严重脱水不足的组织中间发软，甚至还会有水。

脱水的关键是如何使低浓度的酒精脱水时间和高浓度的酒精脱水时间的正确搭配，低浓度的酒精可以使组织收缩减少，并使组织更好切，高浓度的酒精使组织脱水更彻底。

一般情况下，标本脱水时间（35℃）以75％酒精

1.5小时,85％酒精2小时、95％酒精（2道大）各1个半小时至2小时、纯酒精（2道）各1个半小时至2小时。

小标本脱水时间与大标本差异不大，一般没必要分开，小标本发脆，往往是因为纸包太厚或相互粘在一起，导致组织脱水不彻底引起。

如果由于时间关系，也可适当相应缩短。

脱水时间长短，与室温高低有密切的相关,同时也与组织的厚薄，组织类型，组织固定的程度等条件都有关。

我们在实践中发现，室温在12～15℃时，可作为一个临界温度范围。

当室温高于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间；而室温低于该温度范围时，应适当延长脱水时间。

从规范化角度出发，应该尽可能的减少变量，也就是：

温度、浓度和作用时间。

如果一年四季都在一个恒定的温度下（35℃）最好，有条件的应该买全封闭自动脱水机。

更换脱水液，应以量为基础，定量更换。

根据我科经验，如试剂用量为500ml，每500个蜡块更换一次为宜。

在更换脱水液时，不提倡全部试剂向前退的方法，因为此法不能保证低浓度的酒精的浓度（往往会偏高），所以我们认为85%的酒精不能退到75%的酒精里，95%的酒精不能退到85%的酒精里，无水酒精不能退到95%的酒精里，而第二道的95%的酒精可以退到第一道95%的酒精里，第二道无水酒精也可以退到第一道无水酒精里。

由于脱过水的酒精含有大量的脂肪和蛋白质，因此，最好全部更换，要保证各梯度酒精的真正浓度。

只有这样才能做好每一批组织。

常规切片脱水的原则就是在最短的时间内，使组织脱水彻底，收缩度、硬度适中，切片舒展、好切。

在固定充分的情况下，组织在酒精内长时间停留并不会使组织发脆，那怕是无水酒精，那怕是几天。

5.透明

为了使石蜡能够浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。

目前最好的透明剂是二甲苯。

很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点并不正确，在固定充分、脱水彻底的情况下，二甲苯并不会引起组织发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织（比如子宫肌瘤等）由于透明充分而变的更好切。

而所谓的发脆，往往是组织浸蜡充分，使组织恢复到其原有的质地，在蜡块冰冻的情况下产生的，如果用冰水或常温切片，就不会有脆的现象。

所以二甲苯透明（2道）各30-60分钟，如果有时间，时间可以更长，透明充分，蜡也能浸的更充分。

但当组织内有少量水份，二甲苯在高温下将水置换出来，导致组织干烤，可能会导致组织发硬。

6.浸蜡

组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。

目的为了使石蜡渗透到组织中去。

浸蜡温度过高（超过60℃），如果小组织内含有少量水份，会导致小组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以浸蜡用的石蜡熔点应该在54-56℃左右（三道），时间：

第一道：

石蜡30分钟；第二道：

石蜡60分钟；第三道：

石蜡，90分钟以上。

浸蜡温度控制在56～58℃左右。

（第一道也可用硬脂酸石蜡1：

3混合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，染色后核浆比比较鲜明，缺点是容易脱片，疏松组织在展片时容易散开，所以要用后面几道石蜡尽可能将硬脂酸洗净。

所以一般不要使用此法）。

用开放式的脱水机最好每天打开第一道石蜡的盖子，让二甲苯挥发掉。

浸蜡用的石蜡如有杂质应该过滤，以防吸入组织内，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。

7.包埋

用包埋剂来支持组织的过程称包埋。

最常用的是石蜡包埋法。

包埋的关键一是平整，二是方位。

要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。

囊壁、管腔组织应竖直包埋。

小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上，蜡块上下应留有余蜡。

包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。

胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。

包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。

蜡的熔点应在56～60℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。

因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。

8.磨刀

要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。

磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。

磨刀的手法各人不同，但都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。

切片刀应用一次磨一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学，不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。

每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。

现在很多单位都买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。

根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。

一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。

如用一次性刀片，必须及时更换刀口。

粗切的刀口和切片用的刀口最好分开，这样可以节约刀片，也可提高切片质量。

9.切片

切片前要把切片机上有关的螺旋拧紧，并调整好切片刀的角度。

切片的第一步必需粗切。

粗切的厚度大约在15～30微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。

细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切出的蜡片放入温水中。

切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。

过快会导致切片厚薄不均，切片难以展开；过慢会使切片增厚。

切片厚度一般为3～5微米。

切片的要求是完整、薄、均匀。

切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。

在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。

操作切片机时应用力均匀，避免用力过重，减少机器的磨损。

在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增加一个缺口。

切片厚度一般为3～5微米，有人认为：

只要