实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳.docx
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实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
【实验目的】
（1）了解电泳的一般原理，掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。
（2）测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。
【实验原理】
带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象称电泳。
醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物。
血清中含多种蛋白质，当在pH这8.6时，这些蛋白质均带负电，它们在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质所带负电荷多少及颗粒大小不同，所以在同一电场，同一pH环境中涌动速度不同。
本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。
血清中含有清蛋白，α~球蛋白，β~球蛋白，γ~球蛋白和各种脂蛋白等。
各种蛋白质由于氨基酸组分，立体构象，分子量，等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。
分子量小，等电点低，相同碱性pH。
表1人血清中12种蛋白质的等电点及分子量
蛋白质名称肝硬变↓↓阻塞性黄疸无丙种球蛋白血症
等电点（pl）↑↑↑↑
分子量在晚期失代偿时
清蛋白~α球蛋白球蛋白β~球蛋白~γ
4.885.065.126.85-7.50↑↓↓
69000α—2000001α—300000290000—150000
156000—30000
缓冲体系中，带负电喝多的蛋白质颗粒在电场中移动速度快。
例如，以醋酸纤维素薄膜条区带。
清5左右，染色后可显示1h的缓冲体系中电泳pH=8.6为支持物，正常人血清中
球蛋白。
这些区带经洗脱后可用分光光度法~β~及γ~,蛋白泳动最快，其余依次为α~，α21临床医学常利用它们异也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。
定量，常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。
此法由于操作简单，快速。
正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图图1
为点样原点球蛋白，6,αβ~及γ~为清蛋白，2，3，4，5分别为α,21清蛋白球蛋白附注
ααγβ21
妊娠↓↓↓中毒时更明显，产后2-3个月正常↑
6↑个月时γ正常，其他成分婴儿↑↑6-10岁时正常
↓糖尿病异常球蛋白，可在β和γ区带间出现M区带多发性骨髓瘤↑↑↑↑
↑↑↑↓全身性红斑狼疮
↓类风湿性关节炎↑
风湿热↑↑
↓↓↑↑淀粉样变性
↓肾病↓↑↑↑．
（3）优点。
目前，已成为临床生化检验的常规操作之一。
【临床意义】
清蛋白62-72%α—球蛋白3-4%α—球蛋白6-10%β~—球蛋白7-11%γ~—球21蛋白9-18%
血清蛋白电泳的病理改变多半是清蛋白降低和一种或二种以上球蛋白增加。
表2血清蛋白的临床意义
【试剂】
1.巴比妥缓冲液（pH=8.6离子强度为0.06）：
称取巴比妥纳12.76克，巴比妥1.66克，置于盛有200ml蒸馏水的烧杯中稍加热溶解后，移置100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。
2.染色液：
氨基酸B0.5克，加甲醇50ml,冰乙酸10ml，蒸馏水40ml，溶后备用。
3.漂洗液：
甲醇或乙醇45ml，加冰乙酸5ml，蒸馏水50ml混匀即可。
4.洗脱液：
0.4mlNaOH
5.透明液：
冰乙酸25ml，加95%乙醇75ml混匀。
【操作】
1.准备点样：
将薄膜条（8×2cm）侵入巴比妥缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端1.5cm处，用毛细管或玻片取血清呈直线状滴加，等渗入膜内后，将薄膜有样品的一面向下（以防蒸发干）贴在电泳槽架上，两端用浸湿的滤纸作桥贴紧。
盖严，平衡5分钟。
2.通电：
一般电压为120-140V，电流约（0.4-0.6mA/cm）通电45-60分钟，待电泳区带展开约25-35mm后关闭电源。
3.染色：
通电完毕，将薄膜直接浸于染色液中，2-3分钟后取出，用漂洗液清洗数次，脱色至背景为无色。
．
4.定量：
将漂洗净的薄膜吸干，剪下各个蛋白质带，同时按各区带的平均宽度剪下一条空白区带，然后分别浸入0.4MNaOH5ml的试管中，振摇数次，使色泽浸出。
于620毫微米波长处比色，以空白带浸出液调整零点，测各部分光密度为：
A，α，α，β，γ，21按下列方法计算：
光密度总和T＝A+α+α+β+γ21各部分蛋白百分含量为：
清蛋白（%）＝A/T×100%
α球蛋白（%）＝α/T×100%11α球蛋白（%）＝α/T×100%22β球蛋白（%）＝β/T×100%
γ球蛋白（%）＝γ/T×100%
5.透明：
待薄膜完全干燥后，浸入透明液约5-10分钟，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后即成透明的膜，可于光密度计上测定密度，或作标本永远保存。
6.结果分析
【作业与思考】
根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在pH＝8.6的巴比妥缓冲液中移动的相对位置？
实验二ALT测定标准曲线的制作
【实验目的】
了解标准曲线制作的基本过程及使用标准曲线的意义。
．
【波长及在光电地色中滤光法的选择】
λ（nm）滤光片颜色测定介质颜色
黄绿435青紫400—黄435—480蓝
桔红490蓝绿480—红490—绿蓝500
紫绿500—560
蓝紫绿黄560—580
蓝—580595黄
蓝绿桔红610595—绿蓝610—750
红测定实验原理及标准曲线制作】【ALT酮戊二酸生成一定量的丙酮酸及在一定的反应条件下，作用于丙氨酸及α-血清中ALT，2-4-2谷氨酸。
，二硝基苯肼能与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α酮戊二酸生成相应的丙酮酸所形成的苯腙在以相同克分子浓度计算，后者在碱性条件下呈棕色。
4-二硝基苯腙，作用反生成的丙酮酸酮戊二酸的三倍，根据此特点可计算出值为α波长下的505OD-ALT的量，从而推算出酶的活力。
其反应式如下：
-+丙氨酸α酮戊二酸——丙酮酸谷氨酸+4-，+二硝基苯腙水2+肼——丙酮酸4-，+2丙酮酸二硝基苯【试剂】基质液（含适量防腐剂）1.）1mmol/L肼溶液（二硝基苯4-，22.
3.NaOH溶液（4M）使用前用蒸馏水稀释10倍成0.4MNaOH溶液
4.丙酮酸标准液（2mol/L）
【操作方法标准曲线的制作】
1.按下表于各管中加入相应试剂
01234
0.10.1pH7.4磷酸缓冲液0.10.10.1
0.200.150.05ml丙酮酸标准液（）0.100
0.300.400.500.45基质液（ml）0.35
150
—28
（卡门氏单位）相当于酶活动单位97
57
2.在每一管中各加入2，4-二硝基苯肼溶液0.5ml混匀，于37°C水浴放置20分钟后加入0.4MNaOH溶液5.0ml再混匀。
3.室温放置10分钟后，于505nm波长比色，对0号管条零点，读取各管的吸光度，分别以各管吸光度值与对应的卡门氏酶活力单位作图，即成标准曲线。
血清ALT酶活力的测定
【实验目的】
掌握分光光度计的正确使用方法，了解使用标准曲线的意义。
【实验原理】
同ALT标准曲线制作
【实验操作】
取试管2支按下表操作
空白管测定管
0.1
—）ml血清（．
蒸馏水或生理盐水（ml）
0.1
—
基质液（ml）
0.5
0.5
1.将各管分别混匀，置37°C水浴中30分钟后加入2，4-二硝基苯肼溶液0.5ml混匀。
2.再置37°C水浴中20分钟，然后各加入0.4MNaOH溶液5.0ml再混匀。
3.室温放置10分钟后比色，波长为505mm，以空白管调零点，读取测定管的吸光度。
4.计算：
根据测定管的吸光度，从标准曲线上查出相应的酶活力单位。
5.正常值：
5-25赖氏单位
实验三纸层析分离，鉴定氨基酸
【实验目的】
掌握低层析的基本技术，了解分配层析在科研等方面的使用价值。
【实验原理】
将各种氨基酸点在滤纸一端，使层析剂经过点样处，各种氨基酸迁移率不同，经过一段时间后，逐渐在滤纸上集中在不同位置通过测定各种氨基酸的R值，与标准对照，即可知f该成分，其中R＝展层后斑点中心与原点之间的距离／原点与溶剂前缘间距离f在分离样品组分时，还会遇到单向展层分离不好的情况，此时可采用双向展层。
即第一相展层后，除去纸上的溶剂，将滤纸干燥，沿溶剂前沿裁去没有扩展到的部分，转动90度后再用第二相溶剂展层。
【实验操作】
1.取一张剪好的滤纸（勿用手摸）
2.分别用毛细管吸取各氨基酸溶液点在各处点样处（斑点直径不得超过0.5cm），边点边用吹风机吹干，反复3次。
3.取层析剂100ml于标本缸底，将滤纸悬于标本缸层析液中，点样端朝下（点样处不得浸入层析剂中），上端滤纸两解用线固定，并盖好盖子，以防滤纸受潮变软，堕入层析剂中。
4.层析剂展层至上端约1cm时停止，取出标本，用铅笔标出层析剂前沿，用吹风机吹干再将茚三酮均匀喷在滤纸上并吹干。
5.标出各斑点的中心点，泳尺量出点样处至溶剂前沿以及至斑点中心的距离。
6.计算R值。
f7.根据各已知氨基酸的R值，确定混合标本中各氨基酸的成分。
f
8.结果分析。
实验四核酸的提取和鉴定
【实验目的】
通过此实验要求掌握成分分离的一般原理，并熟练掌握离心机的使用
【实验原理】
核酸是生物大分子，根据其分子中所含戊糖不同而分为DNA和RNA两大类。
根据RNA能溶于0.14MNaCl溶液中，而将RNA与其它物质分开，又根据DNA溶于1MNaCl溶液中，而将DNA与其它物质分开。
在加入蛋白质变形沉淀剂氯仿——异丙醇后，经离心可分成三层，上层为DNA或RNA溶液，中层为蛋白质凝胶，下层为氯仿。
所得DNA、RNA溶液分别用HSO42在沸水中水解，可得其各种化学成分，再根据各化学成分特性分别予以鉴定。
【试剂】
1.0.14MNaCl
2.1MNaCl
3.氯仿——异丙醇
4.95%乙醇
5.5%HSO4
26.3，5-二羟基甲苯：
称取3，5-二羟基甲苯1.5克，加入浓盐酸500ml，再加入10%氯化高铁20—30滴，贮于冰箱。
此试剂应在临用前配置。
7.二苯胺：
称取1.5克二苯胺，溶于100ml冰醋酸（A、R）中，在加入浓HSO1.5ml摇42匀贮在棕色瓶中放冰箱内保存。
8.5%HgNO39.浓氨水
10.钼酸铵：
称取钼氨酸5克溶于100ml蒸馏水中，再加入浓硫酸15ml待冷却后加入蒸馏水1000ml。
此试剂可于冷处保存一月不变质。
11.氨基萘磺酸：
取195ml15%碳酸氢钠溶液，加入0.5克纯炼的氨基萘磺酸及20%硫酸钠溶液5ml。
并在热水浴中搅拌使固体溶解（如不能全部溶解，可再加20%硫酸钠溶液，但加入量以1ml为限）。
置冷处可保存2—3周。
如颜色变黄时，须重新配置。
测定时将上述溶液用蒸馏水稀释10倍。
【实验操作】
（一）分离提取
去肝组织3克，研磨成匀浆，加入0.14M氯化钠5ml，充分混匀，3500r/min离心10秒后分成两部分：
（二）鉴定
1.嘌呤碱鉴定：
嘌呤碱在碱性条件下可与硝酸银作用生成白色沉淀
水解液（滴）
20
1
2
—
5%硫酸（滴）浓氨水（滴）结果判断
—
3
203
结果分析磷酸鉴定：
2.
OO12M+12H→POH+12HMOHPO2043230443·磷钼酸钼酸磷酸
12MPOO→H3M·OOPO·6MH54030202·343钼蓝
1
2
水解液（滴）
10
—
10—5%硫酸（滴）
5钼酸铵（滴）5
氯化亚锡（滴）
3
3
结果判断
结果分析核糖鉴定：
3.
核糖——→糠醛——→绿色化合物21
水解液（滴）4—4硫酸（滴）5%—6
6
—二羟基甲苯（滴）5，3．
结果判断
结果分析
4.脱氧核糖鉴定
脱氧核糖——→w-羟基γ-酮记戊醛——→蓝色化合物
1234
1）111缓冲液（pH6.8ml0.5
0.5%Cl淀粉液（ml）0.5
0.5
0.5
置于冰水浴5分钟置于37°水浴5分钟
1
2
—20水解液（滴）
20—5%硫酸（滴）30
30
二苯胺（滴）
结果判断
结果分析
实验五环境因素对酶活性的影响
【实验原理】
唾液淀粉没能将淀粉水解，生成各种糊精，最后可生成麦芽糖。
淀粉与碘反应成蓝色，糊精根据分子大小，与碘反应呈紫、红等不等颜色。
麦芽糖不与碘呈色。
根据以上特征，可用来判断淀粉水解的过程，并判断在不同条件下（温度、pH、激动剂、抑制剂）对酶活性的影响。
【试剂】
1.0.5%淀粉液（不含Cl）
2.0.5%含Cl淀粉液：
每100ml淀粉液中加NaCl0.3克
混匀50.4ml磷酸二氢钾1/15M加入49.6ml磷酸一氢钠1/15M磷酸缓冲液：
pH6.83.
即可。
4.2%在碘液
5.pH5.0磷酸缓冲液：
0.2M磷酸一氢钠在pH计下以0.2M盐酸调节至pH5.0
6.pH8.0磷酸缓冲液：
1/15M磷酸一氢钠94.7ml加入1/15M磷酸二氢钾5.3ml
7.1%硫酸钠溶液
【实验操作】
《温度对唾液淀粉酶活性的影响》
1.收集唾液、并用蒸馏水稀释500—1000倍（依个人的酶活性而定）。
2.取试管2支，各加入稀释唾液5ml，一管直接加入煮沸，另一管置冰水浴中预冷5分钟。
3.另取试管4支，编号，按下表操作。
温室唾液预冷唾液各加2ml
煮沸唾液稀释唾液2ml2ml
摇匀仍置摇匀仍置冰水浴10分钟37℃水浴10分钟
2滴℃水浴移置滴2372滴碘液
分钟后加入碘10液结果
结果分析对唾液淀粉酶活性的影响》pH《
取试管3支编号按下表操作
123
pH8.01pH5.01磷酸缓冲液（ml）pH6.81
0.50.50.50.5%含Cl淀粉液（ml）
稀释唾液（ml）
22
2
保温碘液结果
℃水浴保温均置于37滴滴22
10分钟滴2
结果分析《激动剂、抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响》取试管5支编号按下表操作
ml）pH6.8缓冲液（
231111
5411
0.5含0.5%cl0.5淀粉液（ml）0.5
）（cl0.5%不含淀粉液ml1%硫酸钠（滴）硫酸铜（滴）2%
0.50.52
22
2
）ml稀释唾液（2
2
2
2
均置于保温37℃水浴10分钟
222碘液（滴）22
结果
结果分析．
实验六饱食、饥饿状态下肝糖原水平的比较分析
【实验目的】
通过实验要求掌握糖代谢的相关理论，并在科研技能方面得到一定的培养。
【实验原理】
用三氯醋酸破坏肝组织的酶并沉淀蛋白质而保留糖原，糖原不溶于乙醇而溶于热水。
糖原溶液呈现乳样光泽，遇碘呈红棕色，本身无还原性，在酸性溶液中加热可水解为具有还原性的葡萄糖，后者可将碱性铜溶液（班氏试剂）中二价铜还原为氧化亚铜。
利用上述性质，可测定组织中糖原的存在。
【试剂】
1.5%三氯醋酸
2.95%乙醇
3.0.9%氯化钠
4.浓盐酸
5.50%氢氧化钠
6.碘试剂：
称取碘100mg和碘化钾200mg溶于30ml蒸馏水
7.班氏试剂：
称取柠檬酸钠173g和碳酸钠100g溶于蒸馏水700ml中，加热促热，冷却后，慢慢倾入17.3%硫酸铜100ml边加边摇，再加蒸馏水至1000ml混匀，如混浊可过滤，取滤液，此试剂可长期保存。
【实验操作】
氯化钠洗去附着0.9%去饱食、饥饿小白鼠各一只迅速处死小白鼠，立即取出肝脏，用1.
的血液，并用滤纸吸干。
2.分别将肝组织迅速剪碎并放入盛有5%三氯醋酸2ml的研体中，将组织研磨至靡状，再加5%三氯醋酸1ml于肝组织中，混匀后将肝匀浆倾入离心管中。
再加1ml15%三氯醋酸清洗研体，洗液也倾入离心管中，然后离心3000转/分，5分钟。
3.取上清液，加入95%乙醇3ml、混匀，静止10分钟，3000转/分离心5分钟，倾去上清夜，可见：
（饥饿：
饱食：
）
4.分别加蒸馏水3ml于上述沉淀管中，加热使沉淀溶解，可见：
（饥饿：
饱食：
）
5.分别去上管溶液2滴于白瓷凹盘中，加热碘试剂一滴，观察颜色。
（饥饿：
饱食：
）
6.在上管溶液中，各加入浓盐酸10滴，置于沸水浴中10分钟，取出冷却，用50%氢氧化钠0.5ml中和。
7.分别将上管加入班氏试剂2ml煮沸1—2分钟，观察并记录所见。
（饥饿：
饱食：
）
结果分析．
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