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论文研究计划

论文研究计划

题目:

砷胁迫下水稻灌浆期籽粒响应的代谢组学及

蛋白质组学研究

姓名:

杨欢

报考学院:

农业与生物技术学院

报考专业:

作物栽培学与耕作学

毕业院校:

中国农业科学院

毕业时间：

2017年7月

论文研究计划

一、论文题目：

砷胁迫下水稻灌浆期籽粒响应的代谢组学及蛋白质组学研究

二、研究目的：

从代谢组学和蛋白质组学的角度来分析不同水稻品种籽粒对砷胁迫的耐受响应。

大量的代谢和蛋白质数据可以丰富我们对水稻砷耐性差异分子机理及水稻应答砷胁迫的分子机制的理解。

三、研究背景：

水稻是全球主要的粮食作物之一，但其产量与质量受到重金属污染、干旱、高温等非生物胁迫作用的影响。

砷是一种理化性质与金属相似的类金属元素，在环境学中也被归为重金属，砷及化合物具有剧毒、致癌、致畸和致突变特性（IARC，2004）。

研究表明水稻具有高效的砷吸收、富集和向地上部分转运的能力，其稻谷中的砷富集量约是其他和谷类作物如小麦、玉米的10倍（Tuli,etal.2010）。

近年来，针对水稻砷形态、代谢规律、吸收、富集和转运机理的研究工作取得一定成果。

尽管低浓度的无机砷能够促进部分水稻的发芽率，但随着砷浓度的升高多数水稻的发芽率下降，甚至不能发芽（李仁英等,2014）。

但一定浓度的砷胁迫不仅影响发芽和水稻植株的正常，还会使水稻颖壳出现重颖、封闭不拢等畸形症状，结实率仅有30％～40％，结实籽粒不饱满甚至短小（X建军等,2014）。

此外，砷胁迫对稻米的品质也存在一定的影响，整精米率、垩白米率、垩白度以及蛋白质含量显著下降，碱消值增加（即稻米蒸煮后口感硬，食味不良）等（曹莹等,2013）。

在植物体内砷的毒性与其存在的形态有关。

一般将环境中存在的砷分为两类：

无机砷和有机砷。

砷酸盐（AsⅤ）和亚砷酸盐（AsⅢ）属于无机砷，其中As（Ⅲ）的毒性要大于As（Ⅴ）；有机砷包括单甲基砷酸（盐）（MMA）、二甲基砷酸（盐）（DMA）、砷甜菜碱和砷糖等，主要存在于海洋动物和食用藻类中（Zhao,etal.2009）。

Verbruggen等（2009）研究表明有机砷比无机砷的毒性低，但当五价的MMA（AsⅤ）和DMA（AsⅤ）被还原为三价的MMA（AsⅢ）和DMA（AsⅢ），会大大增大其毒性。

As（Ⅲ）对植物的毒害作用大于As（Ⅴ），但两者对植物的毒害作用机理不同。

As（V）主要通过干扰P代谢对植物产生毒害，而As（Ⅲ）主要干扰植物体内的蛋白质和酶，因此不同形态的砷对植物生长的影响不同。

（康瑞娟等,2005）

不同水稻品种对As的吸收、转运和耐性均存在显著差异。

目前对耐砷和砷敏基因型水稻工作集中在基因组和转录组水平上研究水稻响应砷胁迫的生理机制。

Rai等（2011）发现，水稻品种Triguna、IR-36和PNR-59比较耐砷，它们在遭受砷胁迫后其基因组中硫同化代谢及抗氧化系统等相关基因被显著诱导表达。

Liu等（2010）对籼稻明恢86进行亚砷酸盐胁迫处理，在幼苗根系中鉴定到67个应答砷胁迫的miRNA，这些miRNA的靶基因主要包括一些转录因子、蛋白激酶、DNA或金属离子结合蛋白，它们参与细胞和代谢过程、色素沉着和应激反应等。

不同形态的砷在不同基因型水稻籽粒中也存在显著的差异。

在生殖阶段，水稻中的ABC转运因子（OsABCC1）可减小As转运分配至籽粒中。

（Song,etal,2014）

众所周知，蛋白质是大多数生理、生化过程的实际执行者，在蛋白质水平上研究可获得大量有价值的信息。

通过蛋白质组学研究发现不同的逆境胁迫能对蛋白质组产生一些共同的影响，如抗氧化酶体系活性的上调、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）活性的降低以及热激蛋白分子的表达增强（肖清铁等,2011）。

不同逆境胁迫下蛋白质的表达也会有所不同，因此研究不同胁迫下响应逆境胁迫差异蛋白质的表达变化，可以帮助我们加深对植物-逆境因子互作关系的认识。

前人采用包括双向电泳在内的多种技术策略进行了大量关于植物响应非生物胁迫因子的蛋白质组学研究。

在研究不同重金属胁迫下对水稻叶片蛋白质变化时发现铜、铬、汞等金属元素对水稻叶片蛋白质表达的影响很大，重金属胁迫后水稻体内Rubisco酶活性降低，而SOD、OsPR5以及OsPR10等抗性相关蛋白的表达增加。

对水稻根系响应胁迫的蛋白质组学研究表明，SAMS、GSTs、CS、CST-tau和TSPP等调节蛋白的表达量呈上升趋势。

（Ahsan,etal.2010）砷对水稻叶片的压力能导致二磷酸核酮糖羧化酶的减少，从而降低光合作用速率。

Requejo等（2006）发现，与对照相比，在As（Ⅴ）或As（Ⅲ）胁迫下，产生的差异蛋白中有7种与细胞氧化的关系密切。

植物对重金属等逆境胁迫的调节和适应是一个综合的反应，涉及基因调节、转录后调节、翻译后修饰和代谢反馈等多个生物学水平的系统调节。

生物受到生物或非生物胁迫后导致体内代谢紊乱，代谢产物是其表达的最终产物。

植物对于外界环境的刺激所产生的响应是一个复杂的代谢反应，致使代谢物的种类、含量发生变化，进而造成代谢物所参与的代谢途径发生改变。

因此，利用代谢组学技术来研究植物应对逆境胁迫下的代谢活动受到越来越多的关注。

2013年，Wu等（2013）利用代谢学技术，以野生大麦和培育大麦为研究对象，比较了盐胁迫下二者的代谢差异，发现植物受到盐胁迫后其植物体内有82个代谢物的种类和含量都发生了变化，并进一步探讨了耐盐机理，为筛选耐盐性较强的大麦品种提供理论依据。

Morsy等（2007）以耐冷型和冷敏感型的水稻为研究对象，基于高效液相色谱（HPLC）仪器分析探讨了二者于低温胁迫下糖类代谢组学差异，研究表明耐冷型水稻中积累了较多的半乳糖和棉子糖。

Holmes等（2003）利用NMR进行了麦瓶草悬浮细胞在Cd胁迫条件下的代谢组学分析，结果发现经Cd处理的麦瓶草悬浮细胞内的苹果酸和醋酸盐类的代谢产物含量均升高，而谷氨酸及其支链氨基酸的含量均降低。

Navarro等（2017）以水稻日本晴品种为试验材料，利用HPLCQ-Exactive分析日本晴在重金属Cd胁迫下的代谢物及代谢途径发生的变化，所鉴定到74个代谢物含量均发生变化，涉及到的代谢途径主要为氨基酸代谢、嘌呤代谢、碳代谢以及甘油脂代谢。

目前，关于关于砷胁迫水稻的蛋白质研究主要集中在根茎叶等其他组织，但系统将水稻灌浆期的籽粒代谢变化和蛋白质差异综合分析的研究还鲜有报道。

因此，开展砷胁迫下水稻灌浆期籽粒的代谢组学和蛋白质组学比较研究，有可能为砷在籽粒富集提供有价值信息，从而为培育低砷水稻品种提供理论基础。

四、研究内容：

1、为研究水稻籽粒耐砷性蛋白质的响应，本试验利用同位素标记的相对和绝对定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ）标记技术与GO功能注释的生物信息学相结合，分析低砷突变体和野生型灌浆期籽粒中的蛋白质表达谱。

鉴定在砷处理后籽粒中的蛋白质含量变化和变化蛋白质参与的代谢途径。

2、利用Q-TOFLC/MS结合代谢组学分析砷胁迫籽粒响应的代谢产物，并进行KOBAS（KEGGOrthologyBasedAnnotationSystem），分析低砷突变体和野生型水稻籽粒灌浆期砷处理后的差异代谢物可能参与的代谢途径，可能包括氨基酸代谢、有机酸代谢等代谢途径，这些代谢途径的变化可能与低富集品种的耐性相关。

五、创新点：

本研究将代谢组学和蛋白质组学系统地结合起来，实现对水稻籽粒在砷胁迫后的蛋白质和代谢物的差异性研究，为籽粒富集砷的机理研究提供技术支持。

六、研究技术方案：

1、材料选择及培养

采用采用低砷突变体（lowarsenic,las）和野生型（9311，WT）为实验材料进行水培实验，设置一系列浓度梯度处理。

水稻播种前将种子在蒸馏水中浸泡4h后用2%的次氯酸钠消毒30min，再用清水反复冲洗数次。

种子催芽在35℃黑暗条件下的人工培养箱中进行。

待种子露白后均匀播撒在1L塑料黑色桶的培养网中，培养箱的条件设置为：

第一段温度为35℃，相对湿度75%，光照强度80%，时间14h；第二段温度为25℃，相对湿度75%，光照强度0%，时间10h。

待水稻培养至三叶一心时，选取长势健壮一致的水稻幼苗移栽至容积6L，内装有5L培养液的塑料黑色桶中，每桶5穴，每穴3株，用树脂塑料板将各穴分隔开来，并用海绵进行固定。

水培所用营养液按照国际水稻研究所（IRRI）推荐的配方配制，并选择用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH调pH值至5.5～6.0。

在幼苗移栽两周后，向培养液中加入一系列浓度梯度的砷溶液，对照组CK即为不加砷处理。

每个处理设置3次重复，培养液每三天更换一次营养液。

待培养至水稻灌浆期再对籽粒进行取样。

2、水稻籽粒中蛋白的提取及iTRAQ标记

参考An等（2015）的方法，称取0.5g经液氮研磨的水稻灌浆籽粒样品于50mL离心管中，加入5mLPBS缓冲液（100mmol/L,pH7.4），冰浴下高速匀浆超声30s，于4℃、10000g条件下离心30min。

取上清液分别加入50μL1mol/LDTT使其终浓度为10mmol/L，于56℃条件下反应30min；加入适量125μL1mol/LIAA使其终浓度为25mmol/L，于37℃条件下避光30min。

先加入等体积（5mL）的预冷丙酮混匀至无可见颗粒状物质，再加入5倍体积的预冷丙酮剧烈震荡后置于-20℃条件下静置3h，4℃离心机中10000g离心45min，倒掉上清液后再加入等体积的有丙酮:

水=6:

1清洗沉淀一次，离心30min后将上清液倒掉后置于空气中自然晾干。

用1mL50mMNH4HCO3（pH8.0）溶解，于4℃、10000g条件下离心30min，取上清液测定蛋白质浓度。

取200μL蛋白溶液后按酶:

蛋白=1:

50的比例加入Trypsin酶在转速为500rpm37℃的金属浴中酶解2h，加入20μL甲酸终止酶解反应。

将固相萃取小柱（MILI-SPEExctractiondiskCartridge,3mL,C18-SD）装入15mL离心管中，加入1mL甲醇，1500g离心1min；加入0.5mL70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），1500g离心1min；加入0.5mL0.1%甲酸水溶液，1500g离心1min；将酶解后的肽段样品加入小柱中，200g离心5min；加入0.5mL甲酸溶液，以200g离心3min；将固相萃取小柱取出置于新的15mL离心管中，加入0.5mL70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），200g离心5min，再加入0.5mL70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），重复洗脱一次，洗脱液即为脱盐后的混合肽段溶液。

采用8-plexiTRAQkit（AppliedBiosystems,Framingham,MA）按说明书进行标记。

将脱盐后的样品冻干后重新溶解于30μL0.5M三乙基碳酸氢铵（TEAB），pH8.0中。

将每份iTRAQ试剂溶解于70μL无水乙醇，再八份每份均为100μg的样品中分别加入iTRAQ试剂，在室温放置1小时后加入10μL1MTris-HCl（pH8.5）终止反应。

因样品中含有的各种缓冲液会影响后续的质谱分析，所以在进行液相质谱分析前需要在Agilent1100HPLC系统上用离子交换色谱法纯化所得到的样品。

3、代谢物提取

参照Li等（2015）的方法：

称取经液氮研磨的水稻籽粒样品粉末400mg，加入4mL预冷（‒20°C）的甲醇溶液，涡旋混匀1min，加入10.8mLMTBE，涡旋混匀1min，加入7.2mL水，涡旋混匀1min，室温放置10min，在4°C以12000r/min离心20min，分层后分别取上下层溶液，其中上层为非（弱）极性代谢物，下层为极性代谢物，离心浓缩后用初始流动相复溶，待测。

4、数据采集及分析

Agilent）软件进行数据预处理。

关键参数设置：

基线噪音水平≥600counts，绝对峰高≥6000counts，质量窗口0.5Da，时间窗口0.5min，代谢物提取算法类型：

小分子化合物（色谱）。

蛋白质分析通过LTQ-Orbitrap和Xcalibur（Version2.07,美国Thermo公司）软件进行样品采集，数据分析在ProteomeDiscover软件（Version2.0,美国Thermo公司）中利用SEQUEST软件在水稻数据库（Oryzasativasubsp．Japonica（Ｒice）.fasta）中检索鉴定。

检索设置参数为：

所有肽段设置为胰蛋白酶酶切，最大允许2个漏切位点，前体离子的质量容忍度设置为10ppm，碎片离子的质量容忍度设置为0.6Da；设定半胱氨酸残基C端为固定修饰+57Da，Met（M）+15.995Da设为可变修饰；使用precolator卡值，使所有肽段鉴定信息的假阳性率控制在1%以内，确保鉴定结果更为可靠。

5、砷含量测定

参照巩佳第等人（2014）的方法，取待测稻米样品于磨粉机中研磨成粉末，准确称取1.0g置于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL0.3mol/L硝酸水溶液，涡旋混匀，再置于石墨消解仪中在95℃下提取90min。

将提取液冷却至室温，在8000r/min下离心15min，取上清液过0.22μm滤膜后，用LC-ICP-MS分析。

六、研究阶段：

第一阶段：

认真学习代谢组学和蛋白质组学的基本知识，包括对KEGG代谢途径和GO功能注释等生物信息学分析数据库的学习。

掌握LC-QTOF-MS、LC-QTRAP-MS和LC-ICP-MS等大型仪器的使用和维护。

系统地翻阅与砷胁迫研究相关的文献，摸索确定实验方案和研究内容。

（预计第一年完成）

第二阶段：

按照建立的实验方案，种植水稻并进行砷胁迫处理，用水培的方法培养至灌浆期。

对灌浆期籽粒取样，并预处理后进行代谢产物、蛋白质和砷提取并测定。

对所测得的数据进行分析关联（预计第二年完成）

第三阶段：

收集相关的研究资料，初步确定论文课题的思路和写作结构，待课题开题和中期考核通过后开始论文的写作。

（预计第三年完成）

七、预期达到的效果：

1、运用蛋白质组学结合GO功能注释等生物信息学分析技术找到砷胁迫下水稻灌浆期籽粒中的蛋白质变化，并找出变化的蛋白质参与的功能信息。

2、对籽粒中代谢产物分析结合KEGG代谢途径分析注释变化的代谢产物参与的重要代谢途径，并定位至代谢途径的一个环节。

3、结合蛋白质组学、代谢组学和籽粒中砷含量变化的信息关联性，分析砷胁迫

后灌浆期籽粒的响应机制，为研究籽粒富集砷的机理提供参考。

八、参考文献：

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21.巩佳