水中大肠杆菌的检测方法.docx
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水中大肠杆菌的检测方法
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水中大肠杆菌群检测办法－多管发酵法
一.办法概要
本办法系用以检测水中革兰氏染色阴性,不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌,且能在35±1℃.48±3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliformgroup）;在不合体积或不合稀释度之水样所产生之成果,以「100mL水中最大可能数（MPN/100mL）」暗示100mL水中消失之大肠杆菌群数量.
二.实用规模
本办法实用地面水体.地下水体.废水.污水及水源水质水样中大肠杆菌群之磨练.
三.干扰
（一）水样中含有克制或促进大肠杆菌群细菌发展之物资.
（二）检测应用的玻璃器皿及装备含有克制或促进大肠杆菌群细菌发展的物资.
四.装备
（一）量筒：
100至1000mL之量筒.
（二）吸管：
有刻度之10mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管,或无菌微量吸管（micropipet）.
（三）试管：
大小约150×15mm之试管或有盖螺旋试管.
（四）发酵管（fermentationtube）：
大小约22×9mm之玻璃管.
（五）稀释瓶：
容量约100mL可灭菌之硼硅玻璃成品.
（六）锥形瓶：
200至2000mL之可灭菌硼硅玻璃成品.
（七）采样容器：
容量120mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器,或市售无菌袋.
（八）冰箱：
温度能保持在4±2℃者.
（九）天平：
待测物重量大于2g时,须能精秤至0.01g;待测物重量不大于2g时,须能精秤至0.001g.
（十）造就箱：
温度能保持在35±1℃者.
（十一）高压灭菌釜：
温度能保持在121℃（压力约15lb/in2或1.1Kg/cm2）灭菌15分钟以上者.
（十二）高温干热烘箱：
如用于玻璃器皿等器具之灭菌,温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者.
（十三）接种环：
为白金或镍铬合金制,实用于细菌接种或移植,亦可应用无菌塑料成品.
（十四）pH计：
精确度达0.1pH单位.
五.试剂
（一）试剂水：
蒸馏水或去离子水,导电度在25℃时小于2μmho/cm（μS/cm）.
（二）造就基,应应用市售商品化造就基.
１.硫酸月桂酸胰化蛋白胨造就基（Laurylsulfatetryptosebroth,简称LST）
1倍浓度LST造就基含有下列成份：
胰化蛋白胨（Tryptose）
乳糖（Lactose）
氯化钠（NaCl）
磷酸氢二钾（K2HPO4）
磷酸二氢钾（KH2PO4）
硫酸月桂酸钠（Sodiumlaurylsulfate）
试剂水1L
配成2倍浓度（取71.2gLST造就基粉末溶于1L试剂水）,完整消融后,分取10mL注入装有倒置发酵管之试管内,经121℃灭菌15分钟,冷却后备用,灭菌后造就基之pH值应在.灭菌后造就基若未当日应用,应保管在4±2℃,保管刻日为14天.可根据磨练需求量,依配方配制造就基.
２.煌绿乳糖胆汁造就基（Brilliantgreenlactosebilebroth,简称BGLB）
1公升的BGLB造就基中含有下列成份：
蛋白胨（Peptone）
乳糖（Lactose）
牛胆粉（OxgallPowder）
煌绿色试剂（BrilliantGreen）
试剂水1L
取40gBGLB造就基粉末溶于1L试剂水,完整消融后,分取5至10mL注入装有倒置发酵管之试管内,经121℃灭菌15分钟,冷却后备用,其pH值应在.灭菌后造就基若未当日应用,应保管在4±2℃,保管刻日为14天.可根据磨练需求量,依配方配制造就基.
（三）无菌稀释液
１.磷酸二氢钾储备溶液
取3.4g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50mL的试剂水中,俟完整消融后,以1.0NNaOH溶液调节其pH值为,然后加试剂水至100mL,灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用.4±2℃下保管刻日为3个月.
２.氯化镁储备溶液
取8.1g氯化镁（MgCl2‧6H2O）,先溶于少量试剂水,俟完整消融后,再加试剂水至全量为100mL,灭菌（过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟）后,储存于冰箱中备用.4±2℃下保管刻日为3个月.
３.无菌稀释液
分离取10mL氯化镁储备溶液和2.5mL磷酸二氢钾储备溶液再参加试剂水至2,000mL,混摇平均后,分装于稀释瓶中,经121℃灭菌15分钟,作为无菌稀释液备用.如欲用于水样稀释,分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90±2.0mL.4±2℃下保管刻日为3个月.
六.采样与保管
（一）盛装水样磨练微生物之容器,应应用干净并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋,且于采样时应防止受到污染.水样若含有余氯时,无菌容器中应参加适量之无菌硫代硫酸钠（采纳加氯之废水时,每100mL水样中参加0.1mL.10%硫代硫酸钠可还原15mg/L余氯.采纳含氯之饮用水水样时,每100mL之水样如参加0.1mL之3%硫代硫酸钠,可中和之余氯量约为5mg/L.）.
（二）采样前应干净手部,再行采水样,所采水样应具有代表性.
（三）输送时水样温度应保持在小于10℃且不得冻结,而实验室内保管温度应保持在4±2℃.
（四）水样应于采样后24小时内完成推定实验之水样添加步调（七.步调
（一）４.）,并置入造就箱中造就.
（五）水样量须以能做完所需磨练为度,但不得少于120mL.
七.步调
实验分两阶段进行.起首进行推定实验,若推定实验成果为阳性反响,则持续进行第二阶段之肯定实验,如成果仍是阳性反响则显示有大肠杆菌群消失.各实验步调如下述：
（一）推定实验
１.慎选发酵管中没有气泡且未污染之10mL.2倍浓度LST试管.
２.水样在进行检测或稀释之前必须激烈摇摆25次以上,以使样品充分混摇平均.
３.视水样中微生物可能浓度规模进行水样稀释步调,应用无菌吸管汲取10mL水样至90mL无菌稀释液中,形成10倍稀释度水样,混杂平均,尔后自10倍稀释度水样以雷同操纵方法进行一系列恰当之100.1000.10000倍等稀释水样,进行稀释步调时,均需改换无菌稀释吸管,水样稀释步调如图一所示（注1）.
４.以无菌吸管分离取各稀释度10mL水样至内含10mL2倍浓度的LST试管中,每一稀释度各作5支,当心混杂平均,混杂后发酵管内不成产朝气泡.
５.在35±1℃造就箱中造就48±3小时,不雅察并记载发酵情况,如有气体产生则推定实验为阳性反响,若无气体产生则推定实验为阴性反响,但若造就液呈混浊状况,虽无产气,亦应进行肯定实验.
（二）肯定实验
若推定实验之发酵管中有气体或混浊产生时,则应用BGLB进行肯定实验：
１.慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管.
２.应用无菌接种环自产朝气体以及混浊之LST造就基试管中,接种一圈造就液至BGLB造就基试管中.
３.在35±1℃造就箱中造就48±3小时.
４.在48±3小时内,BGLB造就基试管如有气体产生,则肯定实验为阳性反响.
八.成果处理
（一）经肯定实验确认BGLB试管为阳性反响后,应以「100mL水中最大可能数（MPN/100mL）」盘算及记载.5支发酵管持续三种稀释度之MPN可查表一.
（二）表一所示接种之水样量为10mL.1.0mL及0.1mL,若所用之稀释度有三种以上时,采取最具意义之三种稀释度,查表后再盘算100mL水中大肠杆菌群最大可能数.稀释度之拔取方法如下：
１.先拔取5管均呈阳性反响的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全体呈阳性反响）,再拔取下两个稀释度（如表二水样别a）.
２.假如稀释度最低的一组并不是5管均呈阳性反响,则拔取稀释度最低的一组,再拔取下两个稀释度（如表二水样别b.c）.
３.假如根据上述原则（１.及２.）拔取3个稀释度后,下一稀释度试管组仍有阳性反响试管,则舍弃本来3组中稀释度最低的一组,纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）.
４.假如根据上述原则（１.至３.）拔取3个稀释度后,更高稀释度之试管组仍有阳性反响试管,则把更高稀释度之阳性反响试管数加至本来3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）.
（三）100mL水中大肠杆菌群最大可能数（MPN/100mL）之盘算公式如下：
成果小于100时,以整数暗示（小数字数四舍五入）,菌落数大于100以上时,只取两位有用数字：
例如110以1.1×102暗示,16,000以1.6×104暗示.
（四）检测记载须注明采样时光.造就肇端及终了时光.造就基名称.造就温度及各稀释度的数据等相干数据.
九.质量治理
（一）微生物采样人员及检测人员应具备微生物根本练习及常识.
（二）每批次采样时应进交输送空白.
（三）每批次或每10个水样需进行试剂空白实验.
（四）新购入之造就基,每批号均须以大肠杆菌群阳性掌握菌株（如E.coli.Enterobacteraerogenes.Citrobacterfreundii）进行测试,以确保数据质量.
（五）若一季时代水样均未检出大肠杆菌群,则须以大肠杆菌群菌株进行造就基测试,以确保数据质量.
（六）本办法造就所得之细菌可能具有沾染性,检测后之造就基及器皿应经高温高压灭菌处理.
十.周详度及精确度
略
十一.参考数据
（一）APHA.2005.StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,21stEdition,Section9221.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C.
（二）Difco&BBLManual:
ManualofMicrobiologicalCultureMedia.2003.BDDiagnosticSystems.
注1：
水样如须稀释,建议于稀释后30分钟内完成检测步调,以免造成细菌逝世亡或增生,影响实验成果.
图一 水样稀释步调
表一
三持续稀释度（10mL.1mL.0.1mL）五试管反复测试时,阳性成果组合之MPN指数及95%信任区间
阳性反响组合
MPN/100mL
95%信任区间
阳性反响组合
MPN/100mL
95%信任区间
下限
上限
下限
上限
0-0-0
<1.8
—
6.8
4-0-3
25
9.8
70
0-0-1
1.8
0.090
6.8
4-1-0
17
6.0
40
0-1-0
1.8
0.090
6.9
4-1-1
21
6.8
42
0-1-1
3.6
0.70
10
4-1-2
26
9.8
70
0-2-0
3.7
0.70
10
4-1-3
31
10
70
0-2-1
5.5
1.8
15
4-2-0
22
6.8
50
0-3-0
5.6
1.8
15
4-2-1
26
9.8
70
1-0-0
2.0
0.10
10
4-2-2
32
10
70
1-0-1
4.0
0.70
10
4-2-3
38
14
100
1-0-2
6.0
1.8
15
4-3-0
27
9.9
70
1-1-0
4.0
0.71
12
4-3-1
33
10
70
1-1-1
6.1
1.8
15
4-3-2
39
14
100
1-1-2
8.1
3.4
22
4-4-0
34
14
100
1-2-0
6.1
1.8
15
4-4-1
40
14
100
1-2-1
8.2
3.4
22
4-4-2
47
15
120
1-3-0
8.3
3.4
22
4-5-0
41
14
100
1-3-1
10
3.5
22
4-5-1
48
15
120
1-4-0
10
3.5
22
5-0-0
23
6.8
70
2-0-0
4.5
0.79
15
5-0-1
31
10
70
2-0-1
6.8
1.8
15
5-0-2
43
14
100
2-0-2
9.1
3.4
22
5-0-3
58
22
150
2-1-0
6.8
1.8
17
5-1-0
33
10
100
2-1-1
9.2
3.4
22
5-1-1
46
14
120
2-1-2
12
4.1
26
5-1-2
63
22
150
2-2-0
9.3
3.4
22
5-1-3
84
34
220
2-2-1
12
4.1
26
5-2-0
49
15
150
2-2-2
14
5.9
36
5-2-1
70
22
170
2-3-0
12
4.1
26
5-2-2
94
34
230
2-3-1
14
5.9
36
5-2-3
120
36
250
2-4-0
15
5.9
36
5-2-4
150
58
400
3-0-0
7.8
2.1
22
5-3-0
79
22
220
3-0-1
11
3.5
23
5-3-1
110
34
250
3-0-2
13
5.6
35
5-3-2
140
52
400
3-1-0
11
3.5
26
5-3-3
170
70
400
3-1-1
14
5.6
36
5-3-4
210
70
400
3-1-2
17
6.0
36
5-4-0
130
36
400
3-2-0
14
5.7
36
5-4-1
170
58
400
3-2-1
17
6.8
40
5-4-2
220
70
440
3-2-2
20
6.8
40
5-4-3
280
100
710
3-3-0
17
6.8
40
5-4-4
350
100
710
3-3-1
21
6.8
40
5-4-5
430
150
1100
3-3-2
24
9.8
70
5-5-0
240
70
710
3-4-0
21
6.8
40
5-5-1
350
100
1100
3-4-1
24
9.8
70
5-5-2
540
150
1700
3-5-0
25
9.8
70
5-5-3
920
220
2600
4-0-0
13
4.1
35
5-5-4
1600
400
4600
4-0-1
17
5.9
36
5-5-5
>1600
700
—
4-0-2
21
6.8
40
表二
判读解释
水样别
水样体积（mL）
阳性反
应组合
成果
（MPN/100mL）
10
1
a
5/5
5/5
2/5
0/5
0/5
5-2-0
×102
b
4/5
5/5
1/5
0/5
0/5
4-5-1
48
c
0/5
1/5
0/5
0/5
0/5
0-1-0
2
d
5/5
4/5
4/5
1/5
0/5
4-4-1
×102
e
5/5
4/5
4/5
0/5
1/5
4-4-1
×102
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