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项目研究计划书

项目名称：

使用动态观测技术进行单胚胎移植的前瞻性随机对照研究

项目负责人：

龚斐

项目执行人：

孔祥怡

实施时间：

2015.7-2016.12（暂定）

中文摘要：

多胎妊娠是目前辅助生殖技术面临的严重并发症之一，实施单胚胎移植是潜在的有效解决途径。

由于缺乏有效的评估胚胎发育潜能的指标，仅依靠目前的形态学指标选择囊胚移植尚不能获得满意的妊娠结局。

探索更有效的胚胎评估方法来选择具有最佳发育潜能的胚胎进行单胚胎移植尤为重要。

而动态观测技术（time-lapse）为胚胎的评估及选择提供了新的途径。

本研究拟探索本中心自主研发的基于胚胎分裂动态观测的指标来选择卵裂期胚胎的模型是否能有效地预测卵裂期胚胎的囊胚发育能力，采用该方法选择单个卵裂期胚胎移植后是否与依靠囊胚培养获得的单个囊胚移植具有相同的妊娠效率。

为进一步临床应用提供依据，为最终在不降低胚胎妊娠率的情况下减少胚胎移植数，控制多胎妊娠的发生率奠定基础。

英文摘要：

Atpresent,multipregnancyistheoneoftheseriouscomplicationsofassistedreproductivetechnology.Theimplementationofsingleembryotransferisaneffectivesolution.Whileduetothelackofeffectiveevaluationcriteriaofembryos,relyonthemorphologicalcriteriaonlycannotbringaboutsatisfypregnancyoutcome.Toexploremoreeffectivemethodtoassessandchoosethebestdevelopmentpotentialembryofortransferisparticularlyimportant.Thedynamicobservationtechnology（time-lapse）provideanewwaytoevaluateandselectembryo.Weintenttoexplorewhethertheembryoselectionmodelofourearlyresearchbyusingtime-lapseobservationcanpredicttheblastocystdevelopmentalabilityofcleavageembryoeffectively.Andwhetherwecanadoptthemethodtochooseasinglecleavagestageembryototransplantwiththesameefficiencyofpregnancyofsingleblastocysttransplantation.Finally,byusingthismethod,whetherwecancontroltheincidenceofmultipregnancybyreducingthenumberofembryotransferwithoutreducingtherateofembryopregnancy.

中文关键词：

单卵裂期胚胎移植，单囊胚移植，动态观测，多胎妊娠

英文关键词：

Singlecleavage-embryotransfer,singleblastocysttransfer,Time-lapse,multipregnancy

一、实验背景

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）已成为不孕症治疗的常规手段。

传统的方法往往采用同时移植多个胚胎以提高妊娠率，但其带来一项严重的并发症-多胎妊娠。

在IVF-ET中，多胎妊娠的发生率高达30%，是自然妊娠中多胎妊娠率的20-50倍。

多胎妊娠会导致孕产妇发生妊娠高血压综合征、子痫、妊娠糖尿病，胎儿出现低出生体重、脑瘫、中枢神经系统发育异常等的风险增加。

目前认为单胚胎移植与双胚/多胚移植相比，能有效减少这些医源性并发症的发生。

但在卵裂期单胚胎移植的妊娠效率低，有研究报道其妊娠率徘徊在20%左右。

目前大多实施的单胚胎移植方法是运用囊胚培养选择发育潜能好的胚胎进行单囊胚移植。

但缺乏预测胚胎发育潜能的有效指标，并有研究表明，囊胚培养延长了胚胎体外培养的时间，有可能增加单绒毛膜及同卵双生率，并增加表观遗传学改变的风险，导致中期流产及新生儿出生缺陷甚至影响婴儿的长期健康。

鉴于单胚胎移植的出生率较低，目前需要探索更有效的评估方法来选择具有最佳发育潜能的胚胎进行单胚胎移植。

而动态观测技术（time-lapse）为胚胎的评估及选择提供了新的途径。

动态观测技术（time-lapse）胚胎培养环境更为稳定，不会对胚胎带来任何不良的电磁场影响，且获取的胚胎发育信息量要远远大于单纯的定时形态评估，包括了从受精卵到卵裂期胚胎或囊胚的一系列生物学变化，如原核的形成及消失、卵裂时间特点及同步性、卵裂过程有无异常行为、胚胎碎片的产生及重吸收等。

这些新的发育行为学指标已经帮助胚胎学家更有效地评价胚胎质量，运用卵裂时间、卵裂同步性、囊胚形成等新指标建立的模型可以有效筛选出发育潜能高的胚胎，同时降低选择染色体异常胚胎的风险。

并且最新的前瞻性研究认为，Time-lapse形态动力学模型有助于筛选发育潜能更好的胚胎且有助于提高持续妊娠率及植入率，并在临床应用上取得了良好的效果。

但形态动力学指标受到多种因素影响，如培养条件，母亲年龄，卵子成熟度，受精方式及促排方案等，造成各实验室的适用指标不尽相同，且同一指标的在各实验室不完全一致，每个实验室需根据自身条件探索及建立各自适用的胚胎筛选模型。

前期研究（国家自然科学基金，批准号：

81222007）中，我们根据分裂模式这一定性指标建立了新的能适用于各实验室的胚胎等级筛选模型。

我们发现不同卵裂时期的异常分裂模式对胚胎发育有不同影响，我们观察到七种主要的异常卵裂模式：

发育阻滞、分裂异常、分裂次序紊乱、卵裂球碎裂、大碎片、不等大、胞质异常运动。

我们根据分裂行为对囊胚形成的影响将异常卵裂模式分为两大类，结合前三次卵裂，探讨了异常卵裂模式与囊胚形成的关系，建立了新的胚胎等级预测模型（图1）。

运用该模型筛选出的最优胚胎囊胚形成率可达94.8%，其中可供移植的A、B、C级胚胎植入率分别在70%、50%、20%左右，该研究成果已经被Reproductive BioMedicine Online杂志接收，并申请国际专利（国际申请号：

PCT/CN2014/080289）。

但这一模型的有效性仍需临床前瞻性随机对照研究加以验证。

图1：

胚胎等级预测模型

NC：

正常分裂；C-I：

不等大，大碎片，胞质异常运动；C-II：

分裂异常，发育阻滞，分裂次序紊乱，卵裂球碎裂

本研究中，我们希望通过临床前瞻性随机对照研究验证上述胚胎等级预测模型的有效性，探讨卵裂行为是否能有效预测胚胎发育潜能，将该模型用于单胚胎移植，希望在不降低妊娠率的基础上，降低多胎妊娠率及其带来的风险。

二、实验目的

研究目的是探索本中心自主研发的基于胚胎分裂动态观测的指标来选择卵裂期胚胎的模型是否能有效地预测卵裂期胚胎的囊胚发育能力，采用该方法选择单个卵裂期胚胎移植后是否与依靠囊胚培养获得的单个囊胚移植具有相同的妊娠效率。

为进一步临床应用提供依据，为最终在不降低胚胎妊娠率的情况下减少胚胎移植数，控制多胎妊娠的发生率奠定基础。

三、研究内容及方法

本项目为单中心、前瞻性、随机、对照临床研究，拟运用本中心前期研究建立的利用Time-lapse技术以分裂行为作为筛选指标的胚胎筛选模型对具有优质胚胎的卵裂期（D3）移植患者进行单胚移植（A组），以具有优质胚胎的囊胚期（D5）移植患者作为对照（B组），运用囊胚评分选择优质胚胎，比较两者妊娠结局有无差别。

一、研究类型：

前瞻性随机对照试验

二、入选标准：

1、年龄≤36岁；

2、第一或第二鲜胚取卵周期；

3、月经周期第三天FSH水平≤12IU/L；

4、2PN数大于6

5、行单胚胎移植；

6、签署知情同意书；

三、排除标准：

1、反复流产史；

2、子宫内膜异位性疾病；

3、双侧或单侧输卵管积水（B超检查并未做结扎处理）；

4、子宫畸形、子宫腺肌瘤、多发子宫肌瘤，子宫肌壁间肌瘤>3cm，粘膜下肌瘤；

5、需要行PGD、PGS者；

四、研究路线

本研究拟运用本中心前期研究建立的利用Time-lapse技术以分裂行为作为筛选指标的胚胎筛选模型对具有优质胚胎的卵裂期（D3）移植患者进行单胚移植（A组），以具有优质胚胎的囊胚期（D5）移植患者作为对照（B组），运用囊胚评分选择优质胚胎。

具体实验流程如下图。

五、研究终点：

主要研究终点：

持续妊娠率—妊娠12周后B超检查可见胎心；

次要研究终点:

·植入率

·早期流产率

·宫外孕发生率

·多胎率

六、收集数据的时间点为：

访视1：

取卵后第一天入组日（包括基线和人口学特征的数据收集）

在基线日将收集下列数据：

·研究者向受试者说明研究情况，受试者签署知情同意书

·知情同意书签署的时间

·根据入选/排除标准筛选受试者

·就诊日期（初次就诊日期）

·出生日期

·身高、体重、BMI

·基础FSH、基础LH、基础E2水平的日期（月经周期的第2-4天）

·HCG日激素水平

·不孕原因、不孕年限

·获卵数

·受精率（正常受精、异常受精）

访视2：

取卵后第三天或第五天移植日

收集以下数据：

·优胚数/优胚率

·囊胚形成率

·优质囊胚数

·移植日期

·移植日内膜厚度

·移植前日内分泌水平

·移植胚胎/囊胚评分

如果周期取消（如内膜薄、无囊胚形成等），应在病例报告表中记录原因。

这次访视就成为这名受试者的末次访视。

访视3：

临床妊娠评估

胚胎移植后4周超声检测临床妊娠（具有胎心搏动的胎囊数、妊娠位置，多胎妊娠按一次临床妊娠计算，如无临床妊娠本次访视为受试者的末次访视）及宫外孕。

访视4：

持续妊娠评估

持续妊娠（胚胎移植后12周左右，随访持续妊娠状况，记录是否出现早期流产。

本次访视或者随访为末次访视）

七、研究结束

当受试者符合下列情况时，认为她完成了研究：

·周期取消（其他原因如急性感染、身体原因等）

·没有可移植胚胎

·确认了妊娠状态（如果可能，直至持续妊娠）

·受试者失访

·发生符合排除标准的事件

·受试者撤回知情同意书

收集观察终止的原因。

八、样本量计算

根据文献报道，A组持续妊娠率为21.6%；B组持续妊娠率为33.1%；认为两组移植持续妊娠率差异约10%。

按照非劣效性试验样本含量计算公式，以持续妊娠率为研究终点，在5%的显著水平下，为确保80%的检验效能每组需要246例患者。

考虑到20%的脱落率，每组需要295例患者，总共需要收集590例患者，实际研究样本扩大到600例。

九、统计学方法:

1、随机化方案：

随机：

由随机数字表法产生随机数字，例如：

07，46，31，50，34，90，47，……。

定义：

0-4：

D3移植组；5-9：

D5移植组。

根据受试者顺序编号对应的随机数字入组，设置隐蔽信封。

受试者入组分配：

受试者获得知情同意书后，受试者将被记录至筛选和主要受试者日志中，并分配一个受试者编号，受试者编号将按顺序分配给受试者。

受试者根据入组顺序的隐蔽信封入组。

如果受试者接受或者不接受随机分组以及如果受试者完成试验或提前退出，研究者必须保留有关受试者姓名、编号、签署知情同意书日期的记录。

如果受试者不适合参加这项临床研究，必须在筛选和主要受试者日志中记录原因。

2、统计学分析

主要终点：

分析试验组与对照组移植后持续妊娠率的差异。

用卡方检验进行显著性检验。

次要终点:

分析试验组与对照组移植后胚胎植入率、流产率、宫外孕发生率、多胎率等的差异。

3、统计分析软件

SPSS,版本19.0

十、患者基线资料：

基础FSH、基础LH、基础E2、注射日E2、注射日P、注射日PRL、注射日T、注射日LH、注射日FSH、移前1天PRL、移前1天P、移前1天E2、中重度OHSS、获卵数、受精卵、优胚率等。

四、实验意义

利用Time-lapse胚胎分裂动态观测的指标更好地选择发育潜能最好的胚胎进行移植，为最终在不降低胚胎妊娠率的情况下减少胚胎移植数，为控制多胎妊娠的发生率奠定基础。

五、实验进度安排及预期结果

1、实验进度安排

为减少本研究可能带来的妊娠率下降的风险，拟将以上研究分阶段完成，第一阶段每组约选取50例患者参与，对其妊娠率进行初步评估；在初步分析不会明显降低妊娠率的情况下则进行下一阶段研究；在每组完成约选取100名病人的时候，进行疗效的中期评估。

以上两阶段初步确定有效地前提下，继续完成本研究的所有病例。

本项目拟于2015年7月启动，根据病人入组情况分阶段完成研究，具体时间安排如下（视患者入组情况有延长研究进度的可能）：

2015.7-2015.10完成第一阶段入组，并对其妊娠率进行初步评估；

2015.11-2016.3完成第二阶段入组及评估；

2016.4-2016.9完成第三阶段入组及评估；

2016.10-2016.12完成数据资料收集与分析。

视访：

第一次访视：

取卵后第一天入组日

第二次访视：

取卵后第三天或第五天移植日

第三次访视：

妊娠

1）胚胎移植后4周评价临床妊娠率、早期流产率

2）胚胎移植后12周评价持续妊娠率

2、预期结果

达到本研究目的，实现运用我中心自主研发的基于动态观测胚胎分裂行为的指标来选择卵裂期胚胎的模型能够有效地预测卵裂期胚胎的囊胚发育能力，且采用该方法选择单个卵裂期胚胎移植后与囊胚培养后由传统形态学方法选择的单个囊胚移植具有相同的妊娠结局。

最终实现在不降低胚胎妊娠率的情况下减少胚胎移植数，控制多胎妊娠的发生的目标。

六、课题方案实施技术路线