结蛋白相关心肌病发病机制的分析.docx

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结蛋白相关心肌病发病机制的分析

结蛋白相关心肌病发病机制的分析

南京医科大学博士学位论文

结蛋白相关心肌病发病机制的研究论文摘要

背景：

如同其它的真核细胞，心肌细胞的结构和功能完整有赖于由微丝、微管和中间丝组成的分布广泛的骨架蛋白。

结蛋白（deSmin，des）是心肌主要的中间丝蛋白。

结蛋白表达上调常见于心肌肥厚和充血性心力衰竭等疾病，而结蛋白突变则可引起结蛋白相关心肌病

【desm[n—relatedcardiomyopathy，DRC）和扩张性心肌病。

DRC是结蛋白相关肌病（desmin-rclatedmyopathies，DRM）在

心脏上的表现。

DRM为一散发、家族性的有不同临床表现的神经肌肉疾病，其特点为肌细胞内结蛋白病理性增加。

心脏损害主要表现为传

导异常、心律失常和充血性心力衰竭。

尽管DRM可牵涉到横纹肌和平

滑肌，但通常仅心肌或心肌和骨骼肌受到影响，而且心肌病往往是死亡的主要原因。

到目前为止，结蛋白基因和0【一B～Crystallin（CryAB）的突变被认为与DRM有关。

CryAB作为晶状体主要的结构蛋白，具有分子伴侣活性，在其它蛋白质处于易感状态时，可保护其免受损伤，主要表现为抑制各种蛋白质的凝聚和酶的失活。

由于在DRM的结蛋白异常聚积物中常伴有CryAB和泛素（ubiquitin，Ub），因此泛素蛋白酶体系统（ubiquitin—proteasomesystem，UPS）可能参与了DRM的发病机制。

UPS是细胞内ATP依赖的非溶酶体蛋白降解机制，可高

效并高度选择性地降解细胞内蛋白质，在应激状态下也降解细胞内结构蛋白。

在A1zheimer、Parkinson、Huntington和Creutzfeldt-Jakob等几乎所有的神经退化性疾病的细胞内都可见到Ub化聚积物，UPS功能抑制。

UPS突变与神经退化性疾病和先天性心脏病有关。

然而DRC的异常蛋白聚积物是否损害USP功能，以及它们之间的因果关系目前尚不清楚。

闰盘是心肌电、机械和代谢耦联的结构基础。

它是由非特化肌膜、粘合膜、桥粒和缝隙连接组成的特殊结构。

粘合膜和桥粒与心肌机械

耦联有关，而缝隙连接参与了心肌的化学耦联和电耦联。

在粘合膜，

肌动蛋白（actin）通过结合o【_-aCtinin、vinculin、仪一catenin

（Ⅱ一cat）、B—catenin（Ia-cat）和7-catenin（—rcat），与lj—cadherin（N-cad）相连接，从而强化细胞间的粘附。

由于肌原纤维附着在粘合膜，这使收缩信号可沿胞浆膜扩布。

桥粒由Cadherins、Armodilla家族和p】akins三种超家族组成，在心肌和表皮上广泛存在。

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Cadherins家族的desmoglein和desmocolin通过桥粒斑蛋白（desmoplakin，DP）和P1akoglobin（PG，alsonamedas7-catenin，7-cat）与中间丝如结蛋白（desmin）相连接，提供心肌结构支持。

缝隙连接允许相邻细胞间离子、代谢物和其它信号分子通过由connexins（Cxs）组成膜通道转运，调节着细胞与细胞之间的电流的扩布。

成年心肌组织主要含有connexin40（Cx40）、Cx43和Cx45。

由于结蛋白丝在闰盘纵向插入桥粒，因此DRC紊乱的结蛋白网可能会破坏桥粒结构牙口功能的完整并进而影响闰盘的其它结构，导致闰盘重朔．

目的：

1．研究突变结蛋白（D7一des）转基因小鼠心脏UPS功能，以及异常的蛋白积聚物与UPS损害之间的关系。

2．研究R120G—ccB-crystallin（R120G—CryAB）转基因小鼠心脏UPS功能，以及异常的蛋白积聚物与UPS损害之间的关系。

3．研究CryAB是否可减少突变结蛋白引起的蛋白积聚和改善UPS功能。

4．研究D7-des转基因小鼠的闰盘重塑。

5．研究R120G—CryAB转基因小鼠的闰盘重塑。

方法：

1．取D7-des转基因小鼠和R120G—CryAB转基因小鼠的心肌，提取蛋白，通过WesternblotS观察心室ub化蛋白并测定蛋白酶体肽酶活性。

2．PCR扩增野生型和突变型结蛋白（WT-des和D7-des）eDNA以及野生型和突变型CryAB（WT—CryAB和R120G-CryAB）cDNA，将它们首先克隆到TopoTA载体，胶切纯化后，再亚克隆到pEGFP—Cl质粒，构建真核细胞结蛋白和CryAB表达载体。

3．将含有UPS底物GFPu质粒稳定转染HEK293细胞，筛选细胞，建立稳定表达GFPu的GFPu一1细胞系。

4．用限制性内切酶切割WT-CryAB质粒和GFPu质粒，T4DNA连接酶连接，构建含有WT—CryAB和GFPu的融合表达质粒（CryAB-GFPuo5．将CryAB-GFPu转染HEK293细胞，建立稳定表达WT—CryAB和GFPu的GFPu-2细胞系。

6．将WT—des或D7一des质粒短暂转染GFPu-1细胞，通过Westernblots和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFPu关系．7．将WT-CryAB或R120G--CryAB质粒短暂转染GFPu-1细胞，通过Westernblots和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFPu关系。

8．将WT—des或D7一des质粒短暂转染GFPu一2细胞，通过Westernblots和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFPu关系。

9．提取D7-des转基因小鼠和R120G—CryAB

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转基因小鼠心室组织蛋白，通过Westernblots和免疫标记共聚焦显微镜观察闰盘相关蛋白分布和表达的变化。

结果：

1．D7一deS

（1）D7一des转基因小鼠心肌组织有ub化蛋白积聚，在1个月时就开始升高，6个月达到峰值；使用荧光底物Ⅱ和IⅡ检测体外的D7一des

和WT—des的蛋白酶体肽酶活性。

与WT-des和非转基因动物（NTG）比较，D7一des心肌匀浆可溶性蛋白部分蛋白酶体肽酶活性没有改变，

进一步将不溶性蛋白部分加回可溶性部分检测，NTG和WT—des不溶

性部分显著增加了肽酶的活性，而D7一des小鼠，非溶解部分非但未增加肽酶活性，相反常常降低可溶性部分的肽酶活性。

（2）通过测序证明D7一des和wT—des的cDNA成功地克隆到pEGFP-C1载体中。

质粒短暂转染HEK293细胞后，免疫荧光共聚焦显微镜观察到WT—des结蛋白和cytokeratin在细胞中呈丝网状分布，且影像重叠。

D7-des大部分转柒细胞网状结构消失，胞浆内可见颗粒状或块状聚合物，结蛋白和cytokeratin图像重叠，cytokeratin沉积在结蛋白的聚积物中，Westernblots示结蛋白的表达。

（3）GFPu-1克隆细胞蛋白酶抑制试验，克隆细胞与6州1actacystin孵育8hr后，免疫标记显示在同样荧光强度下，未加lactacystin的细胞荧光暗淡，加入lactacystin后，细胞荧光强度明显增强，GFPu在胞浆和细胞核分布均匀，未见异常聚积物；WesternblOts示与未加lactacystin相比，加入lactacystin后GFPu和[3-cat明显积聚，GFPu增加了约2．5倍，B—cat增加了约1．2倍。

（4）将D7-des和WT-des短暂转染GFPu-1细胞，wT—des和D7-des均可到GFPu和结蛋白，而空白对照和D—gal转染细胞只有GFPu条带。

WT-des和DT-des结蛋白表达基本相同情况下，D7一des的GFPu条带的密度较WT-des增高了约2．7倍，而WT—des的GFPu密度与B—gal转染细胞和GPPu-1细胞空白质粒对照相比没有明显区别。

免疫标记共聚焦显微镜观察WT-des转染细胞胞质均匀，结蛋白呈丝网状分布，GFPu荧光暗淡；D7-des大部分转染细胞均可见颗粒状聚积物，有的成块状，在结蛋白聚积物处，gFPu荧光强度明显增强，结蛋白和GFPu图像重叠。

（5）与WT—des和非转基因（NTG）小鼠相比，D7一des小鼠结蛋白排列紊乱，失去正常的结构，伐一cat、B—cat、N-cad和DP总蛋白明显升高，ct-cat和p—cat以胞浆部分（CF）显著，N-cad膜蛋白部分（MSF）和cF升高，细胞骨架蛋白部分（TIF）

—～塑童垦登查兰堡主兰堡笙查

明显降低，DP的TIF升高，而Cx43总蛋白和TIF明显降低，蛋白存在着再分布。

WT—des与NTG比较，这些蛋白没有明显变化。

三组动物Y—cat和Cx45总蛋白没有变化，未检出Cx40。

免疫标记证实这一结果，闰盘相关蛋白有从细胞两端向侧面分布的趋势。

2．R12OG—CryAB

（1）R120G—CryAB转基因小鼠心肌组织1个月Ub化蛋白开始升高，3个月达到峰值；使用荧光底物测定体外R120G—CryAB和wT—cryAB的蛋白酶体肽酶活性。

WT—CryAB、非转基因动物（NTG）和R120G—CryAB三组动物心肌匀浆可溶性蛋白部分蛋白酶体肽酶活性没有明显变化，但将心肌匀浆不溶性蛋白部分加回可溶性部分检测，NTG和WT—CryAB不溶性部分显著增加了肽酶的活性，而R120G—CryAB小鼠，非溶解部分常常降低可溶性蛋白部分的肽酶活性，与NTG和WT—CryAB相比有显著差异，而NTG和WT-CryAB之间没有明显区别。

（2）通过PCR、酶切图谱和测序证明R120G—CryAB和WT-CryAB的cDNA成功地克隆到pEGFP—C1载体中。

质粒短暂转染HEK293细胞后，免疫荧光共聚焦显微镜观察到wT—CryAB的CryAB蛋白均匀分布在胞浆中，而R120G—CryAB大部分转染细胞的胞浆内可见CryAB呈颗粒状或块状聚合物，WesternblotS示CryAB的表达。

（3）将R120G—CryAB和WT-CryAB短暂转染GFPu一1细胞，wT—CryAB和R120G-CryAB均可到GFPu和CryAB蛋白的表达，而空白对照和13-gal转染细胞只有GFPu条带。

WT-CryAB和R120G—CryAB相比，在蛋白上样量一致的条件下，WT-CryAB较

R12OG—CryAB的CryhB蛋白表达略多，但R120G—CryAB的GFPu条带的密度却较WT—CryAB增高了约2．4倍，而与[3-gal转染细胞和GPPu-1细胞空白对照相比，wT—CryAB的GFPu密度没有明显区别。

免疫标记共聚焦显微镜观察WT-CryAB转染细胞胞质均匀，CryAB在细胞中均质分布，GFPu荧光暗淡；R120G-CryAB大部分转染细胞均可见颗粒状聚积物，有的成块状，在CryAB聚积物处，GFPu荧光强度明显增强，CryAB和GFPu图像重叠。

（4）与WT-CryAB和非转基因（NTG）小鼠相比，R120G-CryAB小鼠结蛋白排列紊乱，失去正常的结构，N-cad总蛋白没有变化，TIF部分下降，而cF部分升高，存在再分布；0【一cat、[3-cat总蛋白升高，p—cat以CF和MSF增加明显，而丫-cat总蛋白没有变化；DP存在由TIF向cF和MSF的再分布；Cx43蛋白表达水平下降，免疫荧光标记Cx43密度下降，分布弥散，但心肌细胞膜侧面荧

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光密度有所增强。

WT—CryAB与NTG比较，闰盘相关蛋白没有明显变

化。

3．CryAB—GFPu转染HEK293细胞，WesternblotS示CryhB和GFPu蛋白的表达。

将D7～des和WT-des转染GFPu一2细胞系，WT—des转染细胞结蛋白成丝网状分布，GFPu荧光暗淡，在细胞中分布均匀，而D7一des转染细胞，结蛋白成细·1、颗粒状，聚积物处GFPu荧光增强；D7一des与WT—des相比，在结蛋白表达相同情况下，GFPu增加了1．6倍。

与D7-des转染GFPu-1细胞系相比，GFPu在D7一des转染GFPu一2细胞系的积聚明显减少。

结论：

1．成功构建了WT-des、D7-des、WT-CryAB、R120G-CryAB和CryAB-GFPu真核细胞表达质粒。

2．成功建立了能反映UPS功能的GFPu-1和GFPu一2克隆细胞系。

3．D7-des转基因小鼠存在UPS功能损害，而异常的结蛋白积聚物是导致UPS功能损伤的原因。

4．R120G-CryAB转基因小鼠存在UPS功能损害，而异常的蛋白积聚物可以直接损伤UPS功能。

5．D7-des转基因小鼠闰盘相关蛋白的蛋白表达水平和分布改变，闰盘重塑，可能是DRC出现心律失常和心肌收缩功能受损的原因。

6．CryAB伴侣功能的下降和结蛋白网状结构的破坏可使R120G-CryAB转基因小鼠闰盘相关蛋白的蛋白表达水平和分布改变，蛋白再分布，可能是DRC出现心律失常和心肌收缩功能受损的原因。

7．CryAB能减少突变结蛋白引起的异常积聚物，改善UPS功能，发挥保护作用。

关键词结蛋白铲B—crystallin结蛋白相关心肌病闰盘转基因

小鼠

————壹蔓堕壁垄堂堡主垒查

Investigationofpathophysiologyofdesmin．relatedeardiomyopathy

Abstract

Backgroud：

Asinothereukaryoticceils，thestructuralandfunctionalintegrityofcardiacmusclecellsdependsonanextensivecytoskeletalsystemwhichconsistsofmicrofilaments，microtubulesandintermediate

filaments（IFs）．Desmin，amuscle—specificIF,isencodedbyasinglegeneandisevolutionarilyconserved．ThedesminIFlatticesurroundstheZ—discs．interconnectsthemtoeachotherandlinkstheentirecontractileapparatustothesarcolemmalcytoskeleton，cytoplasmicorganellesandthenucleus．Thisallowstheformationofacontinuouscytoskeletalnetworkthatcouldbeinvolvedinseveraldiversefunctions，includingmaintenanceofcellularintegrity,forcetransmissionandmechanochemicalsignaling．Upregulationofdesminintheheartoccursinanumberofcardiacdisorderssuchascardiachypertrophyandcongestiveheartfailure，anddesminmutationsayeassociatedwithdesmin—relatdmyopathy（DRM）andidiopathicdilatedcardiomyopathy．

Desmin-relatedcardiomyopathy（DRC）isamajorpartofDRM．DRMis

asporadicandfamilialneuromuscularconditionsofconsiderableclinicalheterogeneityuniformlymarkedbythepathologicaccretionofdesmin．Itmayaffectallthreetypesofmuscle：

skeletal，cardiacandsmoothmuscle．

Alterationsinheartappearedasconductiondefects，arrhythmiasandcongestiveheartfailure．TheresultantDRCisoftenthemaincauseofdeathinDRM．Sofar,mutationsinthedesmingeneandthe口B—crystallin（CryAB）genehavebeenassociatedwithDRM．Asalensprotein，CryABalSOpossesesmolecularchaperonefunction．Itfacilitatedmanyaspectsofproteinfolding，translocation，interactionandturnover,ThepresenceofubiquitinconjugatesandCryABintheproteindepositassociatedwithaberrantdesminaggregatesinmusclecellsinsporadicandhereditaryDRMsseemstolinkthepotentialubiquitin—proteasome

system（UPS）malfimctiontothepathogenesis．UPSisallArP—dependentnonlysosomalproteolyticpathwayinthecytosolofeukaryoticcells，whereitcatalyzestheselectivedegradationofshortlivedregulatory

7

————一塑童垦壁垄兰堡主笙查

proteinsandtherapideliminationofproteinswithabnormalconformation．NearlyallthemostcommonneurodegenerativediseasessuchasAlzheimer’Sdisease，Parinson’Sdisease，Huntington’SdiseaseandCreutzfeldt—Jakobdiseasearecharacterizedbyaccumulationaggregatedproteinwithelevatdubiquitinconjugates．RecentlymutationsintheuPshavebeenlinkedtoseveralneurodegenerativediseasesandcongenitalheartdiseases．However,thespecialcausalrelationbetweenprotein

aggregation，kIPSactivity,andpathogenesishasremainedelusive．

Threetypesofintercellularjunctions：

fasciaeadherens，desmosomesandgapiunctions，havebeenidentifiedintheintercalateddisc．Fasciaeadherensanddesmosomesprovidemechanicalanchorageformyofibrilsandextramyofibrillarcytoskeletontothepolarsarcolemma，andprovideend·to-endlinkagebetweenadjacentcells．Gapjunctionsfacilitatethe

communictonofelectricalsignalsandsmallmoleculesbetweenad．iacent

cells．Inthefasciaeadherens，thebarbendsofactinofterminalsarcomeresarebelievedtolinktoN-cadherinthroughbindingto

仪一actininorvinculin，whichbindsto仪。

catenin。

whichbindsto3-cateninandy-catenin．Inadultmyocardium．N．cadherin／catenincomplexiS

primarilylocalizedtoadherensiunctionsinintercalateddiSCSwhereit

servesasanattachmentsiteformyofibrils．inadditiontoitsstructuralroleinmaintainingmyocyteadhesion．Indesmosomes．desminfilamentsarebelievedtolinktothecadherin-familyproteindesmogleinand

desmocolinsviadesmoplakinandplakoglobin（asloreferedtoas

y-catenin）．Gapjunctionchannelsplayacriticalroleinthepropagationofactionpotentials．Eachgapjunctionchanneliscomposedoftwohexamerichemichannels（connexons）formedofsubunitproteinscalled

connexins．Threedifferentconnexins（Cx40，Cx43，andCx45）are

expressedbycardiacmyocytes．Sincedesminfilamentslongitudinallyinsertintothedesmosomesattheintercalateddisk，itremainsunclear

whetherdisruptionofthedesminfilamentnetworkbyabnormaldesminaggregationaffectstheexpressionanddistributionofthemajorintercalate